張成才，向增旭

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

百蕊草(ThesiumchinenseTurcaz.)為檀香科百蕊屬多年生半寄生草本植物，以“百乳草”之名始載于《本草圖經(jīng)》。百蕊草作為傳統(tǒng)中藥在中國已有上千年的應(yīng)用歷史，具有清熱解毒、補(bǔ)腎澀精之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，百蕊草有良好的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用，有“植物抗生素”的美稱[1-2]。百蕊草在中國各地分布廣泛，生于靠近水體或水源充分的荒草坡、田埂雜草叢中，在沙地草叢中或石坎邊也常見分布，喜溫暖濕潤氣候，喜光照，忌干旱[3]。我國華北、東北、陜西及長江以南地區(qū)是百蕊草的主要分布區(qū)，目前江蘇茅山和安徽滁州為其主要產(chǎn)區(qū)，安徽定遠(yuǎn)縣、明光市等地資源量尤為豐富。近年來，隨著百蕊草過度采挖和其寄主植物的減少，百蕊草資源越來越少，已不再列入藥典[4]。目前，百蕊草需求量不斷增加，百蕊草主要以野生品種供應(yīng)市場，隨著野生資源的逐漸減少，栽培品種越來越受重視，百蕊草的半寄生性、種子存在深度休眠、生長周期長及成活率低等生物學(xué)特性使人工栽培擴(kuò)大百蕊草資源難度較大。本課題組通過設(shè)施栽培在南京地區(qū)成功進(jìn)行百蕊草的引種栽培，但關(guān)于栽培技術(shù)研究結(jié)果和質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)尚未見系統(tǒng)研究，栽培百蕊草的應(yīng)用缺乏科學(xué)依據(jù)。因此，筆者選擇百蕊草素Ⅰ、紫云英苷和山柰酚作為指標(biāo)成分并對其含量進(jìn)行比較分析，以期為栽培百蕊草提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集

供試百蕊草ThesiumchinenseTurcaz.采集于2019年6-7月百蕊草成熟期，供收集了10批百蕊草樣品，野生與栽培樣品各5批，樣品編號為YS1-YS5的藥材由安徽九華藥業(yè)股份有限公司提供，來源信息見表1。經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院向增旭副教授鑒定，所購藥材均為檀香科植物百蕊草ThesiumchinenseTurcaz.的全草，編號為ZP1-ZP5的藥材均采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)八卦洲實驗基地。

1.2 儀器與試劑

AR5120電子天平(美國AHOMS公司)；Waters AC-QUITY UPLC(Waters公司)；便攜式超聲波清洗儀(深圳杰拓科技)。百蕊草素標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉公司)；紫云英苷標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉公司)；山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉公司)；色譜級甲醇(購自Tedia公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(Phenomenex，250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液；梯度洗脫(0 min→5 min→10 min→20 min→45 min，45%→50%→55%→60%甲醇)；進(jìn)樣體積：20 μL；流速：1.0 mL/min；波長：365 nm。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚對照品15 mg、10 mg、10 mg，分別置于10 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1.500 mg/mL、1.000 mg/mL、1.000 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取干燥栽培品和野生品百蕊草全草藥材，剪成5～8 cm小段置于粉碎機(jī)中粉碎，準(zhǔn)確稱取1 g樣品粉末，向粉末中加入25 mL甲醇溶液，稱定質(zhì)量；水浴加熱回流1 h，放冷，稱定質(zhì)量；用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[5-6]。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 分別精密吸取對照品與供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣分析，分別記錄色譜圖，各組分理論塔板數(shù)均>3 000，分離度>1.5[7]。結(jié)果見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品溶液適量，分別置于10 mL容量瓶，用流動相稀釋，定容，配制成不同濃度(μg/mL)對照品溶液。上述對照品溶液各進(jìn)樣20 μL，進(jìn)樣3次，分別記錄峰面積，以對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得到回歸方程，百蕊草素Ⅰ、紫云英苷和山柰酚的回歸方程分別為Y=8 301.2X-35 780，R2=0.998 9；Y=43 593X-4 721.2，R2=0.999 9；Y=77 591X+8 355.6，R2=0.999 8，表明百蕊草素Ⅰ、紫云英苷和山柰酚在2.00～1 000.00 μg/mL、2.00～400.00 μg/mL和0.05～50.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果見圖2。

圖2 (a)百蕊草素Ⅰ校正曲線；(b)紫云英苷校正曲線；(c)山柰酚校正曲線

2.4.3 精密度試驗 取同一供試品溶液(ZP1)，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別按照“2.1”所述方法測定供試品中各色譜峰的保留時間，對照品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的平均保留時間分別為5.110 min、7.354 min、13.674 min，其相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD均小于1%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批次百蕊草藥材(ZP1)6份，每份各約1.0 g，分別按照“2.1”所述方法測定供試品中各色譜峰的保留時間，其相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD均小于1%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批次供試品溶液(ZP1)，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖和各成分峰面積。供試品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的平均峰面積分別為60 113 235.041、1 596 611.503、45 202.100，RSD(n=6)分別為0.93%、2.12%、1.32%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 稱取已知含量的百蕊草藥材粉末6份，每份約0.5 g精密稱定，精密加入濃度分別為1.500 mg/mL、1.000 mg/mL、1.000 mg/mL的對照品溶液1.0 mL，依據(jù)“2.3”所述方法制成供試品溶液，測定百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的含量，計算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

2.5 樣品含量測定

取10批百蕊草藥材，栽培與野生品各5批(批號：YS1、YS2、YS3、YS4、YS5；ZP1、ZP2、ZP3、ZP4、ZP5)，按照“2.3”所述方法制備供試品溶液。對照品溶液和供試品溶液各進(jìn)樣20 μL測定，記錄峰面積。采用外標(biāo)法分別計算10批百蕊草栽培與野生品藥材中百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、山柰酚的含量，結(jié)果見表3。

表3 百蕊草中3種成分含量測定結(jié)果 (n=10)

3 討論

研究表明，黃酮類化合物、有機(jī)酸、生物堿等活性物質(zhì)是百蕊草抑菌作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，以黃酮的抑菌活性最強(qiáng)[7-8]。山柰酚作為最常見的黃酮類化合物，具有顯著的抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒作用，是百蕊草發(fā)揮藥效的主要成分，目前多以山柰酚、百蕊草素Ⅰ和百蕊草素Ⅱ的含量作為百蕊草藥材品質(zhì)控制的主要指標(biāo)[9-10]，百蕊草素Ⅰ和百蕊草素Ⅱ作為百蕊草特有成分，含量較高。因此，本研究選擇山柰酚、百蕊草素Ⅰ和百蕊草素Ⅱ作為測定指標(biāo)，可以較全面地反映百蕊草野生和栽培藥材質(zhì)量。

本研究以百蕊草栽培和野生藥材為研究對象，采用外標(biāo)法對兩者的3種活性成分進(jìn)行測定，結(jié)果表明百蕊草野生品與栽培品中3種成分含量差異較大。以百蕊草素Ⅰ為例，百蕊草栽培品的含量是其野生品的將近2倍，但野生品的紫云英苷含量為栽培品的4.8倍，山柰酚在百蕊草藥材中含量較低，其含量在百蕊草栽培和野生藥材中差異顯著，野生百蕊草藥材山柰酚含量為其栽培品14.33倍，因山柰酚為百蕊草黃酮苷類成分的水解產(chǎn)物，其含量高低受外界環(huán)境條件影響[11]，百蕊草素Ⅰ和紫云英苷的含量在栽培品和野生品中差異顯著，由于中藥藥理作用的發(fā)揮并不依賴于單一化學(xué)成份，而是多種活性成分共同作用的結(jié)果。這些結(jié)果提示：基于目前的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，百蕊草栽培藥材還不能達(dá)到藥用要求，百蕊草栽培品與野生品質(zhì)量尚缺乏一致性，百蕊草野生變家種或野生培育還需進(jìn)一步研究[12-13]。