魯偉 姚軼敏 陳平 陳婷婷

宮頸癌是女性第四大常見(jiàn)癌癥，僅次于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌，在發(fā)展中國(guó)家是僅次于乳腺癌的第2 大常見(jiàn)惡性腫瘤，是最常見(jiàn)的女性生殖道惡性腫瘤[1]。相關(guān)危險(xiǎn)因素包括遺傳易感性、病毒感染、環(huán)境因素等，均與宮頸癌的病因有關(guān)[2]。由于宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及各種遺傳和表觀遺傳學(xué)，如抑制基因的失活和/或癌基因的過(guò)度表達(dá)，識(shí)別癌癥相關(guān)途徑中的失調(diào)基因可能會(huì)闡明腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制[3]。目前，早期和局部晚期宮頸癌患者通常采用根治性治療、化療或聯(lián)合治療，而復(fù)發(fā)和持續(xù)性疾病患者的治療選擇有限。

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)、基因芯片技術(shù)在腫瘤基因組學(xué)研究中逐步應(yīng)用和發(fā)展，對(duì)尋找宮頸癌的發(fā)病機(jī)制、預(yù)后因素和潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義[4-5]。而基因表達(dá)譜結(jié)合生物信息學(xué)分析已被廣泛應(yīng)用于識(shí)別差異表達(dá)基因（DEGs）、功能通路和與宮頸癌發(fā)生、預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因[6]。在本研究中，我們分析了兩個(gè)mRNA 微陣列數(shù)據(jù)集，以獲得宮頸癌組織和正常組織之間的DEGs。通過(guò)DEGs 功能富集和相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)合生存分析和診斷效能分析，進(jìn)一步識(shí)別宮頸癌中的關(guān)鍵基因，為宮頸癌的臨床診療、預(yù)后和藥物設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集收集 我們從NCBI-GEO 庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）獲得了GSE122697、GSE89657在宮頸癌組織標(biāo)本和正常宮頸組織標(biāo)本中的基因表達(dá)譜，這是一個(gè)包含基于微陣列的基因表達(dá)譜的公共數(shù)據(jù)庫(kù)。兩組的微陣列數(shù)據(jù)集均基于GPL570 平臺(tái)（HG-U133-Plus-2，Affymetrix 人類(lèi)基因組U133 Plus 2.0 微陣列）。

1.2 基因表達(dá)譜分析 應(yīng)用GEO2R 在線工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/），結(jié)合臨床資料，對(duì)宮頸癌組織與正常宮頸組織間的DEGs 進(jìn)行篩選（以|log2FC|＞2，P＜0.01 為條件），對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出差異基因。采用維恩軟件在線（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）篩 選兩組數(shù)據(jù)中共同的DEGs。

1.3 基因本體與通路分析 DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）是一個(gè)網(wǎng)站生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，旨在確定相當(dāng)數(shù)量的基因或蛋白質(zhì)的生物功能[7]。基因本體論（GO）是一個(gè)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化分類(lèi)系統(tǒng)，用于定義高通量基因組或轉(zhuǎn)錄組分析獲得的基因及其RNA 或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的獨(dú)特生物學(xué)功能。京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）是一個(gè)由五個(gè)人工管理的數(shù)據(jù)庫(kù)組成的集合，涉及基因組、生物途徑、疾病、藥物和化學(xué)底物。應(yīng)用DAVID 分析DEGs 對(duì)GO 和KEGG 通路的富集程度，P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（PPIs）分析 檢索相互作用基因的搜索工具（STRING）是一個(gè)用于評(píng)估PPIs 的在線數(shù)據(jù)庫(kù)[8]。為了研究這些DEGs 之間潛在的蛋白質(zhì)相關(guān)性，應(yīng)用STRING 和綜合評(píng)分的相互作用≥0.4（中等置信度）被認(rèn)為是顯著的[9]。此外，Cytoscape 軟件用以可視化交互網(wǎng)絡(luò)[10]。利用CytoHubba 插件及MCC 算法對(duì)已構(gòu)建的PPIs 中的分子進(jìn)一步篩選。

1.5 關(guān)鍵基因的TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證 為了驗(yàn)證這些關(guān)鍵DEGs 的表達(dá)，我們應(yīng)用R 軟件Limma 包在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（含數(shù)千個(gè)樣本的測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)）進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 生存曲線及ROC 曲線分析驗(yàn)證宮頸癌的關(guān)鍵基因 利用R 語(yǔ)言軟件的“survminer”（用于可視化）和“survival”（用于生存資料的統(tǒng)計(jì)分析）程序包，對(duì)所得到的關(guān)鍵基因進(jìn)行單/多變量Cox 回歸分析，根據(jù)基因表達(dá)量的中位值將基因分為高表達(dá)和低表達(dá)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，計(jì)算95%置信區(qū)間的和風(fēng)險(xiǎn)比（HR），明確其與宮頸癌患者預(yù)后的相關(guān)性?；赥CGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/），對(duì)得到的與宮頸鱗患者預(yù)后顯著相關(guān)的基因進(jìn)行ROC 曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌DEGs 初步篩選 我們收集了不同系列的原始數(shù)據(jù)（GSE122697、GSE89657），這些原始微陣列數(shù)據(jù)集是標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，利用GEO2R 在線工具，提取微陣列數(shù)據(jù)集的DEGs。隨后，維恩常用圖解軟件獲取存在于兩個(gè)數(shù)據(jù)集交叉的DEGs。癌組織與正常組織比較，共有56 個(gè)共同顯著差異基因，包括15 個(gè)上調(diào)基因（log2FC＞2）和41 個(gè)下調(diào)基因（log2FC＜-2）。

2.2 宮頸癌DEGs 基因GO 及KEGG 通路分析 我們利用篩選的DEGs 進(jìn)行GO 及KEGG 分析。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，所有56 個(gè)共同差異基因通過(guò)David web 工具進(jìn)行了分析。如圖1 所示，GO 分析結(jié)果表明：（1）生物過(guò)程（BP）：上調(diào)的DEGs 在核分裂、有絲分裂姐妹染色單體分離、姐妹染色單體分離的調(diào)控中尤為豐富，而下調(diào)的DEGs 主要在細(xì)胞外基質(zhì)組織調(diào)控；（2）細(xì)胞成分（CC）：上調(diào)的DEGs 主要集中在染色體區(qū)域，下調(diào)的DEGs 主要富集在含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)成分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔；（3）分子功能（MF）：上調(diào)的DEGs 主要富含組蛋白激酶活性，微管結(jié)合，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，而下調(diào)的DEGs 細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合、生長(zhǎng)因子結(jié)合。KEGG 分析結(jié)果顯示，上調(diào)的DEGs 主要在細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞成熟、減數(shù)分裂通路中顯著富集，而下調(diào)的DEGs 在PI3K-Akt 信號(hào)通路、ECM 受體相互作用通路中顯著富集（P<0.05）。

圖1 DEGs 功能富集可視化結(jié)果

2.3 PPIs 構(gòu)建模塊化分析 為了探索篩選出的DEGs 中可能起關(guān)鍵作用的中樞基因在宮頸癌中的作用，采用Cytoscape 基于STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，包括15 個(gè)上調(diào)基因和41 個(gè)下調(diào)基因共56 個(gè)DEGs，去除孤立節(jié)點(diǎn)，生成35 個(gè)節(jié)點(diǎn)和93 條互相作用邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2A）。經(jīng)CytoHubba 插件及MCC 算法分析后，得到與其他蛋白作用最多的前18個(gè)樞紐蛋白的編碼基因：ASF1B、ASPM、AURKA、CENPF、CEP55、DTL、E2F7、FOXM1、MELK、PLK1、APOD、CD34C、CXCL12IGFBP4、IGFBP4、LGALS1、SFRP1，見(jiàn)圖2B。

圖2 DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)

2.4 18 個(gè)樞紐蛋白的編碼基因驗(yàn)證 進(jìn)一步通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證與宮頸癌顯著相關(guān)的基因在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的差異表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常宮頸標(biāo)本相比，所有上調(diào)的10 個(gè)基因均被證實(shí)顯著高表達(dá)（見(jiàn)圖3A），而下調(diào)的8 個(gè)均為顯著低表達(dá)（見(jiàn)圖3B）（P＜0.05）。

圖3 驗(yàn)證TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)鍵DEGs 表達(dá)

2.5 Cox 單/多因素分析關(guān)鍵基因 為了深入了解關(guān)鍵基因與宮頸癌之間的關(guān)系，我們利用包含了大量宮頸癌微陣列數(shù)據(jù)集的TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)R 軟件包單/多因素Cox 分析這18 個(gè)基因的宮頸癌患者總生存率，如圖4A 所示，在宮頸癌患者中，10 個(gè)上調(diào)基因中只有ASF1B 的總生存率顯著改善[HR=0.437（0.272～0.704），P＜0.01]，而8 個(gè)下調(diào)基因中沒(méi)有生存率顯著改善的基因（P＞0.05）。圖4B 顯示，高表達(dá)ASF1B 可顯著增加宮頸癌患者總生存率（P＜0.01）。此外，ROC 曲線顯示ASF1B 可以作為區(qū)分腫瘤和正常宮頸組織的生物標(biāo)志物（AUC=0.998，95%CI：0.993～1.000），如圖4C。

圖4 關(guān)鍵基因的預(yù)后及診斷效能分析

3 討論

本研究基于GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)生物信息學(xué)的方法，利用R 軟件包初步得到DEGs 主要富集于細(xì)胞核分裂、有絲分裂姐妹染色單體分離、細(xì)胞外基質(zhì)組織調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程。KEGG 分析結(jié)果顯示，DEGs 在細(xì)胞周期、減數(shù)分裂、PI3K-Akt 信號(hào)通路、ECM 受體相互作用通路等方面的聚集尤為明顯。利用構(gòu)建DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)及生存分析，我們最終發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因ASF1B 不僅是PPI 網(wǎng)絡(luò)中的樞紐蛋白，而且其高表達(dá)的子宮頸癌患者生存率顯著高于低表達(dá)患者，ROC 曲線顯示其對(duì)宮頸癌有很高的診斷價(jià)值。因此，ASF1B 有可能在子宮頸癌發(fā)生、預(yù)后中發(fā)揮重要的作用。

抗沉默功能1（ASF1）是進(jìn)化上保守的組蛋白H3-H4 分子伴侶，從酵母進(jìn)化到哺乳動(dòng)物，在各種染色質(zhì)基礎(chǔ)過(guò)程中起作用，如DNA 復(fù)制、DNA 損傷反應(yīng)和修復(fù)、DNA 重組和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等[11]。ASF1 同源物B（ASF1B）是ASF1 的亞型，ASF1B 基因位于染色體19p13.12 上，含4 個(gè)外顯子，其編碼蛋白由202 個(gè)氨基酸組成。ASF1B 是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)核絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的底物，通過(guò)保證核小體組裝位點(diǎn)組蛋白的正常供應(yīng)，在調(diào)節(jié)染色質(zhì)核小體結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用[12]。人類(lèi)ASF1B 是轉(zhuǎn)錄因子E2F1 的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的E2F1 基因過(guò)表達(dá)可上調(diào)HeLa 細(xì)胞ASF1B mRNA 的表達(dá)，即ASF1B 的表達(dá)在細(xì)胞周期進(jìn)程中受到轉(zhuǎn)錄因子E2F 的調(diào)控[13]。在細(xì)胞生長(zhǎng)中，當(dāng)細(xì)胞周期結(jié)束時(shí)，與ASF1B 相對(duì)應(yīng)的mRNA 和蛋白表達(dá)量均減少，并且ASF1B 的缺失嚴(yán)重影響細(xì)胞增殖，導(dǎo)致異常的核結(jié)構(gòu)和明顯的異常轉(zhuǎn)錄特征。

ASF1B 的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致不同的轉(zhuǎn)錄特征與細(xì)胞增殖增加和細(xì)胞凋亡減少相一致，誘導(dǎo)了多個(gè)參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因，包括介導(dǎo)G1/S、M 期、染色質(zhì)調(diào)控因子等。此外，ASF1B 過(guò)表達(dá)還抑制一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，進(jìn)而促進(jìn)S 期進(jìn)入有絲分裂的進(jìn)程，顯著誘導(dǎo)β 細(xì)胞增殖[14]。ASF1B 可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)靶向抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。具體來(lái)說(shuō)，ASF1B 的沉默抑制了宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而ASF1B的過(guò)度表達(dá)則加速了癌細(xì)胞的增殖，ASF1B 的缺乏誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。在機(jī)制上，ASF1B 與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶9（CDK9）形成穩(wěn)定的復(fù)合物，并正調(diào)控CDK9 的穩(wěn)定[15]。先前研究顯示，ASF1B 的過(guò)度表達(dá)顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖，可以作為預(yù)測(cè)乳腺癌的一種新的預(yù)后因子，ASF1B 的高水平與癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移發(fā)生率的增加相關(guān)[16]。ASF1B 除了在乳腺癌細(xì)胞中有顯著的過(guò)表達(dá)外，在皮膚、肝臟、卵巢等其他類(lèi)型的惡性腫瘤中也過(guò)度表達(dá)。ASF1B 可促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖與遷移，與Akt/p70S6K1通路的調(diào)控密切相關(guān)[17]。PI3K/Akt 通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，ASF1B 的下調(diào)，可抑制PI3K/Akt 通路，從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[18]。另外有報(bào)道ASF1B 表達(dá)升高與人肺腺癌預(yù)后不良相關(guān)[19]。

人類(lèi)蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站（http：//www.proteinatlas.org/）[20]提供的生存曲線數(shù)據(jù)也證實(shí)ASF1B 可作為腎透明細(xì)胞癌、宮頸癌、胃癌、胰腺癌和肝癌的預(yù)后標(biāo)志物，和我們的結(jié)果一致，宮頸癌和胃癌的ASF1B 高表達(dá)提示有利于預(yù)后，而腎透明細(xì)胞癌、胰腺癌和肝癌則提示不利于預(yù)后。這種同一個(gè)基因在不同類(lèi)型的腫瘤預(yù)后不一致，可能是不同的腫瘤在不同階段基因的激活情況不同，參與調(diào)控的通路不一樣，亦或ASF1B 通過(guò)不同調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程的特定方式不同所致。宮頸癌和胃癌的ASF1B 高表達(dá)，有可能沒(méi)有激活轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的蛋白表達(dá)，或ASF1B 的高表達(dá)有可能提高對(duì)這兩種癌的化療敏感性，降低耐藥，從而提高生存率。我們通過(guò)全面的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)提供了可能對(duì)宮頸癌的發(fā)生、預(yù)后起重要作用的核心基因，可以為未來(lái)宮頸癌的基因個(gè)體化治療提供一些重要的證據(jù)。