陳應(yīng)叢 王國濤 徐道劍

膠質(zhì)細(xì)胞包括小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分[1]。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫細(xì)胞，在脊髓損傷過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞會被激活并且發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2]。細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是一種新發(fā)現(xiàn)的伴隨炎癥發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡方式，分為依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-1）的經(jīng)典途徑和依賴caspase-4、5、11 等的非經(jīng)典途徑[3]。研究表明，脊髓損傷后，其小膠質(zhì)細(xì)胞中caspase-1 表達(dá)明顯上升[4]。因此，通過藥物抑制細(xì)胞焦亡是脊髓損傷的一種潛在治療方式。青藤堿是從我國傳統(tǒng)中草藥青風(fēng)藤中提取的一種活性堿，具有止痛、抗炎及調(diào)節(jié)免疫等功能[5]。研究表明，青藤堿能通過抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）表達(dá)，減緩小鼠關(guān)節(jié)軟骨退變[6]，但青藤堿對脊髓損傷的保護(hù)機制尚不明確。因此，本研究旨在探究青藤堿調(diào)控NLRP3/caspase-1 通路抑制BV-2 細(xì)胞焦亡和炎癥的作用機制，以期為青藤堿治療脊髓損傷的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞 BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，批號TCR14）。

1.2 主要試劑及儀器 青藤堿試劑（武漢谷歌生物公司，批號115-53-7）；胎牛血清（德國SeraPro 公司，批號S601P-500）；DMEM/高糖培養(yǎng)基（美國HyClone 公司，批號SH30022.01B）；CCK-8 試劑盒（杭州蘋谷生物公司，批號AG0063c）；Hoechst/PI 染色試劑盒（杭州蘋谷生物公司，批號AG0045c）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成公司，批號A020-2-2）；抗小鼠一抗硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（TXNIP）、NLRP3、caspase-1、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素18（IL-18）抗體（Abcam 公司，批號ab188865、ab263899、ab179515、ab213818、ab223293），抗兔二抗購自默賽飛公司（批號31234）。2802H 型紫外分光光度計（美國UNICO 公司，型號UV2800）；PCR 基因擴增儀（德國Eppendorf 公司，型號Mastercycler X50）；凝膠成像儀（美國Bio-RAD 公司，型號BIO-RAD Gel Doc XR+）；熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號IX83）。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將BV-2 細(xì)胞分為正常組、氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（OGD/R）組和青藤堿組（20μmol/L）進(jìn)行研究分組。正常組：BV-2 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。OGD/R 組：BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞用Earle’s 平衡鹽溶液培養(yǎng)，置于37℃、1%O2、5%CO2和94%N2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，然后正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)。OGD/R+青藤堿組：BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞用Earle’s 平衡鹽溶液培養(yǎng)，置于37℃、1%O2、5%CO2和94%N2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，然后用含20μmol/L 青藤堿、10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 給藥劑量篩選及CCK-8 檢測細(xì)胞活力 BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)OGD/R 模型處理后，分別用0、10、20、50、100μmol/L 濃度的青藤堿干預(yù)48h。每孔加入10μL CCK-8 溶液，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，酶標(biāo)儀檢測490nm 處各孔的吸光度（OD），以O(shè)GD/R 組（0μmol/L 濃度的青藤堿干預(yù)組）為對照組，計算各組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞相對活性。

2.3 微量酶標(biāo)法檢測BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞LDH 活性將正常組、OGD/R 組和青藤堿組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞分別用胰酶消化后，以1350r/min，離心5min。取120μL 上清液，再加入60μL LDH 檢測液混勻，在避光條件下?lián)u床孵育30min。酶標(biāo)儀檢測490nm 處各孔的吸光度（OD）。以正常組為參照，LDH 相對釋放量=OD 檢測組/OD 正常組。

2.4 赫斯特（Hoechst）/碘化丙啶（PI）染色法檢測青藤堿對BV-2 細(xì)胞焦亡的影響 將BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)于6 孔板中，分別經(jīng)過不同干預(yù)后，使用PBS洗滌3 次。將細(xì)胞染色緩沖液、Hoechst 溶液和PI 溶液以200∶1∶1 比例混勻形成工作液，每孔加入1mL 工作液，4℃避光反應(yīng)30min，PBS 洗滌3 次后，使用熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞焦亡情況。

2.5 RT-PCR 檢測BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá) 分別選取正常組、OGD/R 組和青藤堿組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞操作。具體試驗步驟按照Trizol 試劑盒說明書進(jìn)行，在細(xì)胞中加入Trizol 試劑，室溫靜置10min；加200μL 氯仿混勻后，以12000r/min，4℃離心15min，取上層轉(zhuǎn)移至EP 管；加等體積異丙醇，以12000r/min，4℃離心15min，取底部RNA 沉淀。用預(yù)熱滅菌水溶解沉淀。取4μL 總RNA 加至200μL 滅菌水中，在紫外分光光度儀上測定其OD260 和OD280，計算OD260/OD280。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在20μL 反應(yīng)體積中進(jìn)行，成分如下：總RNA 5μL，隨機引物1μL，ddH2O 4.5μL，70℃固定浴10min；加10μL 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液在42℃固定浴60min，99℃固定浴5min，-20℃保存?zhèn)溆?。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司提供，序列見表1。實時定量PCR 實驗方法：使用寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的SYRB Premix ExTaqTM和ABI 7900 擴增儀進(jìn)行熒光擴增；求出CT 值，檢測TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 基因的表達(dá)情況。

表1 PCR 引物序列

2.6 Western blot 檢測BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白表達(dá)收集細(xì)胞，加入冰預(yù)冷的蛋白裂解液后混勻，超聲破碎細(xì)胞，12000r/min，4℃離心15min 后，提取上層細(xì)胞蛋白，加入5X 上樣緩沖液（體積比4∶1），100℃沸水中煮5min，-20℃?zhèn)溆?。SDS-PAGE 電泳：按照膠配置方法配制不同濃度PAGE 膠，電泳置染料抵達(dá)分離膠底部，斷開電源，取下凝膠，切取帶有要轉(zhuǎn)移蛋白泳道的凝膠。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。封閉：轉(zhuǎn)移結(jié)束后，在TBS-T 液內(nèi)清洗20min，加5%脫脂奶粉，37℃封閉1h。一抗孵育：封閉結(jié)束后，用TBS-T 稀釋第一抗體，將PVDF 濾膜置于其中，4℃震蕩過夜。顯跡：TBS-T 液漂洗PVDF 膜3 次/10min，將膜與TBS-T 稀釋二抗孵育，室溫下振蕩1h；TBS-T漂洗PVDF 膜3 次/10min；TBS 液漂PVDF 膜3 次/10min，X 光膠片上曝光，隨后顯影、定影，用圖像分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的光密度，定量分析TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白的表達(dá)情況。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間的差異比較采用單因素方差分析，為檢驗組間差異，方差分析后作Dunnett’s test。檢驗水準(zhǔn)α 值取雙側(cè)0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 青藤堿對BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響 用10、20μmol/L 青藤堿處理OGD/R 干預(yù)后的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞24h，BV-2 細(xì)胞活性無明顯降低（P＞0.05）。50、100μmol/L 青藤堿處理OGD/R 干預(yù)后的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞24h，BV-2 細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.05）。因此，后續(xù)實驗選取20μmol/L 作為青藤堿的終濃度。見表2。

表2 不同濃度青藤堿對BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞活性影響（%，）

表2 不同濃度青藤堿對BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞活性影響（%，）

注：OGD/R組為OGD/R誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞；10、20、50、100μmol/L 青藤堿組分別為OGD/R 干預(yù)后的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞用相應(yīng)濃度青藤堿處理；OGD/R 為氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧；與OGD/R 組比較，aP＜0.05

3.2 青藤堿降低BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞焦亡的LDH表達(dá) LDH 釋放試驗檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，OGD/R 組細(xì)胞LDH 相對釋放量明顯升高（P＜0.05），20μmol/L 青藤堿處理后，OGD/R+青藤堿組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞LDH 相對釋放量較OGD/R 組顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 青藤堿抑制OGD/R 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞LDH相對活性（）

表3 青藤堿抑制OGD/R 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞LDH相對活性（）

注：正常組為正常培養(yǎng)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R 組為OGD/R 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R+青藤堿組為OGD/R 誘導(dǎo)后，用含20μmol/L 青藤堿的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R 為氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧；LDH 為乳酸脫氧酶；與正常組比較，aP＜0.05；與OGD/R 組比較，bP＜0.05

3.3 青藤堿降低BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞的PI 陽性細(xì)胞數(shù) 經(jīng)Hoechst/PI 染色后，免疫熒光實驗結(jié)果表明，與正常組比較，OGD/R 組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞中PI 陽性細(xì)胞數(shù)明顯上升（P＜0.05），青藤堿作用于OGD/R誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞中PI 陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低（P＜0.05）。見圖1 和表4。

圖1 BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞Hoechst/PI 熒光染色圖（比例尺=500μm）

表4 青藤堿降低OGD/R 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞PI陽性細(xì)胞數(shù)（%，）

表4 青藤堿降低OGD/R 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞PI陽性細(xì)胞數(shù)（%，）

注：正常組為正常培養(yǎng)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R 組為OGD/R 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R+青藤堿組為OGD/R 誘導(dǎo)后，用含20μmol/L 青藤堿的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R 氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧；PI 為碘化丙啶；與正常組比較，aP＜0.05；與OGD/R組比較，bP＜0.05

3.4 青藤堿抑制TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA 的表達(dá) RT-PCR 結(jié)果表明，OGD/R 組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞的TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 mRNA 表達(dá)較正常組明顯上升（P＜0.05），而OGD/R 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)青藤堿處理后，其TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見表5。

表5 青藤堿對TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 mRNA 表達(dá)的影響（）

表5 青藤堿對TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 mRNA 表達(dá)的影響（）

注：正常組為正常培養(yǎng)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R 組為OGD/R 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R+青藤堿組為OGD/R 誘導(dǎo)后，用含20μmol/L青藤堿的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；TXNIP 為硫氧還蛋白結(jié)合蛋白；NLRP3 為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；caspase-1為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1；IL-1β 為白細(xì)胞介素1β；IL-18 為白細(xì)胞介素18；與正常組比較，aP＜0.05；與OGD/R 組比較，bP＜0.05

3.5 青藤堿抑制NLRP3/caspase-1 通路的激活和細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot 結(jié)果表明，相對于正常組，OGD/R 組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞的TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)較正常組明顯上升（P＜0.05）；而與OGD/R 組比較，青藤堿能顯著下調(diào)TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18蛋白表達(dá)水平（P<0.05）。見圖2 和表6。

表6 青藤堿對TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)的影響（）

表6 青藤堿對TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)的影響（）

注：正常組為正常培養(yǎng)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R 組為OGD/R 誘導(dǎo)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；OGD/R+青藤堿組為OGD/R 誘導(dǎo)后，用含20μmol/L青藤堿的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞；TXNIP 為硫氧還蛋白結(jié)合蛋白；NLRP3 為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；caspase-1為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1；IL-1β 為白細(xì)胞介素1β；IL-18 為白細(xì)胞介素18；與正常組比較，aP＜0.05；與OGD/R 組比較，bP＜0.05

圖2 TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白印記圖

4 討論

炎癥是脊髓損傷的重要生物學(xué)過程，及時抑制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)有利于改善脊髓損傷，促進(jìn)脊髓修復(fù)[7-8]。近期有研究進(jìn)一步表明，與炎癥密切相關(guān)的細(xì)胞焦亡在脊髓損傷過程中發(fā)揮著重要的作用[9]。因此，通過藥物抑制細(xì)胞焦亡及炎癥是治療脊髓損傷的可行方案。青藤堿提取于我國傳統(tǒng)中草藥青風(fēng)藤，具有生物活性高等優(yōu)點[5]，是近年來的研究熱點。有研究表明，青藤堿能通過抑制NLRP3 治療缺血性腦卒中、急性肝損傷、骨關(guān)節(jié)炎等疾病[10-12]。因此，本研究以青藤堿為研究對象，觀察其對脊髓損傷模型中小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3/caspase-1 通路的影響。

NLRP3/caspase-1 通路在細(xì)胞焦亡中發(fā)揮重要作用[13]。NLRP3 炎癥小體是由Pro-caspase-1、NLRP3和凋亡相關(guān)微粒蛋白（apoptosis-associated specklike protein containing CARD，ASC）所組成的蛋白復(fù)合體，能進(jìn)一步激活caspase-1。而活化的caspase-1能切割Gasdermin D，形成含有Gasdermin D 氮端活性域的肽段，該肽段能與細(xì)胞膜的磷脂蛋白相結(jié)合并促使細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞破裂，釋放包含LDH 等細(xì)胞內(nèi)容物，致使細(xì)胞焦亡[14]。本研究使用OGD/R 模型處理BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞LDH 釋放量及Hoechst/PI 染色陽性細(xì)胞數(shù)較正常組明顯提升，即細(xì)胞焦亡水平升高。然而，用合適濃度（20μmol/L）的青藤堿處理OGD/R 組的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞后，LDH 活性檢測和Hoechst/PI 染色試驗結(jié)果證實青藤堿能抑制細(xì)胞焦亡。另一方面，隨著細(xì)胞焦亡通路中caspase-1 的激活，活化的caspase-1 能對IL-1β 和IL-18 前體進(jìn)行切割，形成有活性的IL-1β 和IL-18，募集炎癥細(xì)胞聚集，誘發(fā)級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)[15-16]。為了進(jìn)一步探究青藤堿抑制細(xì)胞焦亡的具體機制，本研究通過RT-PCR 和Western blot 技術(shù)檢測細(xì)胞焦亡通路中關(guān)鍵因子TXNIP、NLRP3 和caspase-1 mRNA 和蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青藤堿能夠通過調(diào)控NLRP3/caspase-1 通路抑制BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡及進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究表明，青藤堿可能通過調(diào)控NLRP3/caspase-1 通路抑制BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡及炎癥反應(yīng)，為青藤堿的藥理學(xué)研究和臨床脊髓損傷的治療提供了新的思路。