汪達(dá)青，王卓，何春燕

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州215004)

淋巴細(xì)胞活化基因3蛋白(lymphocyte activation gene-3，LAG3, CD223)是由Triebel等于1990年在活化的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的跨膜糖蛋白，其分子結(jié)構(gòu)與白細(xì)胞分化抗原4(cluster of differentiation 4,CD4)相似，具有免疫球蛋白超家族(immunoglobin superfamily， IgSF)樣結(jié)構(gòu)域[1]。LAG3可作為一種新型免疫檢查點(diǎn)，與相應(yīng)配體結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在免疫自穩(wěn)、免疫細(xì)胞增殖、活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。研究表明，慢性感染和腫瘤微環(huán)境中，LAG3介導(dǎo)T細(xì)胞功能障礙和免疫逃逸，加速疾病惡化[3-4]；而在自身免疫病中，lag3基因缺陷導(dǎo)致的自身免疫耐受性的喪失，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5]。本文就LAG3及其在自身免疫病中的研究進(jìn)展進(jìn)行匯總闡述，以期為自身免疫病的發(fā)病、診斷及治療提供新的認(rèn)知和思路。

1 LAG3結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

lag3基因位于人類(lèi)12號(hào)染色體(12p13.32)和小鼠6號(hào)染色體，與cd4基因相鄰，編碼含有498個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[6]，其結(jié)構(gòu)可分為胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)。LAG3胞外區(qū)與CD4相似，由4個(gè)IgSF結(jié)構(gòu)域(D1—D4)組成，為保證分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，每個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)有1個(gè)二硫鍵，其中D1區(qū)是LAG3與配體結(jié)合的主要位點(diǎn)[1,7]。胞內(nèi)區(qū)負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，由3個(gè)保守序列組成，分別是絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、KIEELE基序和EP基序。研究表明，除KIEELE基序?yàn)長(zhǎng)AG3分子行使功能所必需外，其他區(qū)域的突變對(duì)其功能沒(méi)有影響[8]。此外，D4結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)之間還存在“連接肽”區(qū)域，此區(qū)域含有較長(zhǎng)的氨基酸序列，易被金屬蛋白酶水解，形成可溶性LAG3(soluble LAG3, sLAG3)[7]，sLAG3是否具有功能尚無(wú)統(tǒng)一定論。

2 LAG3表達(dá)

與其他抑制性受體相似，LAG3在NK和T細(xì)胞上誘導(dǎo)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，初始T細(xì)胞的LAG3儲(chǔ)存在溶酶體內(nèi)，經(jīng)PKC信號(hào)介導(dǎo)轉(zhuǎn)移到表面，以防止細(xì)胞過(guò)度活化產(chǎn)生損傷[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，部分免疫細(xì)胞不需要抗原的刺激，靜息狀態(tài)下即可表達(dá)LAG3，如漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)和1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(type 1 regulatory T cells,Tr1)。其中，pDC是目前發(fā)現(xiàn)的LAG3表達(dá)水平最高的免疫細(xì)胞，可通過(guò)LAG3間接調(diào)節(jié)T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[10]，Treg和Tr1的免疫抑制功能也依賴LAG3分子[11-12]。此外，神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)LAG3的存在，神經(jīng)元表面的LAG3可促進(jìn)病理α-突觸核蛋白原纖維(α-synuclein preformed fibrils，α-syn PFF)內(nèi)吞，加速帕金森綜合征疾病進(jìn)展[13]?？傊?，LAG3表達(dá)十分廣泛，更多LAG3+細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及功能有待研究。

3 LAG3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及功能

研究表明，LAG3可與多種配體結(jié)合雙向傳遞信號(hào)，包括MHC-Ⅱ分子、C型凝集素受體LSECtin、半乳糖凝集素-3(Gal-3)、纖維蛋白原相關(guān)蛋白-1(fibrinogen-like protein 1，F(xiàn)GL-1)和α-syn PFF。

MHC-Ⅱ是LAG3經(jīng)典配體。與CD4相比，LAG3與MHC-Ⅱ的結(jié)合親和力約高100倍，但T細(xì)胞內(nèi)，LAG3并不破壞CD4與MHC-Ⅱ的結(jié)合，而是通過(guò)下調(diào)胞內(nèi)STAT5磷酸化的水平以及與LAG3相關(guān)蛋白(LAG-3 associated protein, LAP)相互作用，減少白細(xì)胞分化抗原3(cluster of differentiation 3，CD3)、T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)表達(dá)，限制TCR-MHC信號(hào)驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞增殖，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[14-17]。LAG3與MHC-Ⅱ的結(jié)合在配體細(xì)胞中也傳遞負(fù)向信號(hào)，調(diào)節(jié) FcγRγ和ERK招募Src同源區(qū)2(Src-homology domain 2,SH2)蛋白酪氨酸磷酸酶1(SH2-containing protein tyrosine phosphatase,SHP-1)，抑制細(xì)胞成熟[18]。LAG3還可與LSECtin、Gal-3、FGL-1結(jié)合，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，此類(lèi)配體在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，使CD8+T細(xì)胞分泌γ-干擾素(interferon γ, IFN-γ)、IL-2減少，細(xì)胞免疫作用減弱[19-21]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，LAG3介導(dǎo)LAG3獨(dú)特配體α-syn PFF內(nèi)吞和細(xì)胞傳遞，是引起神經(jīng)元變性的重要驅(qū)動(dòng)因素[13]。LAG3及其受體的研究，為臨床相關(guān)疾病的治療提供新的思路。

4 LAG3與自身免疫病

4.1LAG3與SLE SLE是一種慢性炎癥性自身免疫病，好發(fā)于育齡女性，可累及多個(gè)器官，主要表現(xiàn)為皮疹、陽(yáng)光敏感和關(guān)節(jié)疼痛。研究表明，提高LAG3水平能夠有效減輕SLE自身免疫反應(yīng)，IL-21單抗藥物BOS161721即可逆轉(zhuǎn)患者lag3基因的低表達(dá)，表現(xiàn)良好的治療效果[22]。在易患狼瘡的MRL/lpr小鼠中，LAG+Treg的移植也減少了自身抗體的產(chǎn)生，緩解疾病進(jìn)展[23]，揭示LAG3+細(xì)胞在SLE中獨(dú)特的調(diào)節(jié)作用。

4.2LAG3與多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS) MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，可分為多種表型，包括原發(fā)性進(jìn)行性MS、繼發(fā)性MS、復(fù)發(fā)緩解型MS、臨床孤立綜合征和放射學(xué)孤立綜合征，其中以復(fù)發(fā)緩解型MS最為常見(jiàn)[24]。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)于lag3基因多態(tài)性與MS易感性的關(guān)系，不同地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果并不統(tǒng)一[25-28]。而LAG3分子對(duì)MS作用是肯定的。MS患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中LAG3表達(dá)水平降低，且低殘疾指數(shù)的患者與非低殘疾指數(shù)的患者相比，LAG-3水平顯著升高[29]，這表明LAG3是MS中的重要保護(hù)因素，且與疾病進(jìn)展相關(guān)。LAG3還可在MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和外周血CC族趨化因子受體9(C-C chemokine receptor type 9,CCR9)陽(yáng)性的記憶性T細(xì)胞在發(fā)病期間均可遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過(guò)LAG3抑制自身免疫，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[30-31]。而在對(duì)MS治療措施的研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中LAG3+T細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)Treg、Tr1細(xì)胞的產(chǎn)生，減少炎癥因子的分泌，從而緩解小鼠臨床癥狀[32-34]。

4.3LAG3與1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM) T1DM是器官特異性自身免疫病，由自身反應(yīng)性T細(xì)胞攻擊胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致的胰島素分泌絕對(duì)不足引起，好發(fā)于青少年。NOD小鼠是研究T1DM的常用模型。實(shí)驗(yàn)表明，整體lag3基因缺陷能夠使NOD小鼠發(fā)病提前，胰島T細(xì)胞浸潤(rùn)增加[35-36]。但LAG3在不同細(xì)胞中發(fā)揮的作用并不相同，據(jù)報(bào)道，CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及Tr1上LAG3表達(dá)增加與自發(fā)性糖尿病發(fā)病延遲有關(guān)，而Treg上LAG3的表達(dá)卻限制了其增殖，加速自身免疫的進(jìn)展[37-39]。此外，NOD小鼠血清中sLAG水平與疾病進(jìn)展正相關(guān)，或可作為疾病監(jiān)測(cè)重要指標(biāo)[40]。然而目前為止，LAG3與T1DM的研究?jī)H限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，還需更多臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加以支持。

4.4LAG3與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 作為常見(jiàn)的慢性全身性自身免疫病，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)為對(duì)稱(chēng)性關(guān)節(jié)炎性病變，并隨疾病進(jìn)展，累及心、眼、肺、腎等多個(gè)器官。其中，LAG3+Treg在該病中扮演重要的角色，不僅可指示疾病預(yù)后，還發(fā)揮重要負(fù)向調(diào)節(jié)作用。有學(xué)者指出，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者疾病活動(dòng)指數(shù)越高，LAG3+Treg比例越低；在疾病發(fā)生展過(guò)程中，LAG3+FOXP3-Treg和Tr1均可通過(guò)分泌IL-10，減少自身抗體的產(chǎn)生，抑制關(guān)節(jié)炎癥[41-43]。這些研究表明，通過(guò)藥物誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)LAG3+Treg的產(chǎn)生或許是疾病治療行之有效的方法。

4.5LAG3與銀屑病 銀屑病，又稱(chēng)牛皮癬，是一種慢性復(fù)發(fā)性皮膚炎癥疾病，典型表現(xiàn)為紅色斑塊伴有鱗屑，其發(fā)病與結(jié)締組織內(nèi)異常T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。LAG3在銀屑病中發(fā)揮的作用并不清楚，但針對(duì)LAG3藥物顯示出良好效果。Poirier等發(fā)現(xiàn)向猿猴靜脈注射LAG3嵌合抗體A9H11能夠防止T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的皮膚炎癥[44]，提出LAG3單抗治療銀屑病的可能性。隨后，靶向自身反應(yīng)性T細(xì)胞表面LAG3的抗體—GSK2831781正式進(jìn)入臨床試驗(yàn)[45]，結(jié)果表明，該抗體能夠有效改善銀屑病患者臨床癥狀，揭示LAG3在自身免疫病治療中的巨大潛力。

4.6LAG3與其他自身免疫病 在炎癥性腸病研究中，發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)Treg可通過(guò)LAG3分子與CX3CR1+巨噬細(xì)胞表面MHC-Ⅱ結(jié)合，減少I(mǎi)L-23和IL-1β的產(chǎn)生，預(yù)防結(jié)腸炎[46]。而在Hg誘導(dǎo)的自身免疫病模型中，lag3基因的缺陷使小鼠喪失自身免疫耐受，對(duì)疾病的易感性增加[47]。這些都表明LAG3作為抑制性受體對(duì)自身免疫病調(diào)節(jié)有重要意義，仍需進(jìn)一步研究。

5 LAG3在自身免疫病中檢測(cè)與應(yīng)用

5.1lag3基因多態(tài)性的檢測(cè)lag3基因多態(tài)性不僅與自身免疫病的易感性相關(guān)，也影響著疾病臨床特征[26]。常見(jiàn)的基因多態(tài)性檢測(cè)方法包括序列特異性引物PCR技術(shù)(PCR amplification with sequence specific primers, SSP-PCR)、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR(amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)和Mass-Array，其中，以Mass-Array法應(yīng)用最為普遍。該法是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術(shù)，將PCR擴(kuò)增后的核酸產(chǎn)物電離成單電荷離子，使其在電場(chǎng)的作用下加速通過(guò)飛行管道，從而根據(jù)飛行時(shí)間分析基因型信息。與其他檢測(cè)方法相比，Mass-Array不能檢測(cè)未知突變，但靈敏度高、檢測(cè)速度快、高通量、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)使其應(yīng)用更加廣泛。

5.2LAG3表達(dá)的檢測(cè) 與正常人相比，自身免疫病患者LAG3表達(dá)水平降低，且與疾病進(jìn)展相關(guān)，檢測(cè)外周血中免疫細(xì)胞LAG3表達(dá)情況有助于指示疾病預(yù)后，評(píng)價(jià)藥物療效，其常見(jiàn)方法有實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和流式細(xì)胞術(shù)。RT-qPCR在RNA水平通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化分析基因的表達(dá)情況，而流式細(xì)胞術(shù)則通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面熒光標(biāo)記單克隆抗體結(jié)合情況，在蛋白質(zhì)水平上計(jì)算目的細(xì)胞數(shù)目及比例。2種方法均具有良好的特異性和準(zhǔn)確性，但與RT-qPCR相比，流式細(xì)胞術(shù)不需要提取RNA，細(xì)胞樣本可直接進(jìn)行檢測(cè)，更加簡(jiǎn)便、快速。

5.3血清LAG3的檢測(cè) 血清中LAG3水平升高可作為自身免疫病的輔助診斷策略。ELISA是檢測(cè)血清LAG3常用方法，其基本原理是依賴抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶促反應(yīng)的專(zhuān)一性，使得底物顯色程度與待測(cè)分子含量呈正相關(guān)。ELISA可分為直接法和間接法，其中直接法耗時(shí)少，更為快速，但信號(hào)放大程度有限；間接法靈敏度增加，且同種酶標(biāo)二抗可標(biāo)記不同的一抗，更加經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。

6 小結(jié)和展望

隨著自身免疫病的研究深入，發(fā)現(xiàn)LAG3是建立和維持自身免疫耐受性過(guò)程中不可或缺的分子，在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可作為自身免疫病治療和診斷的潛在靶點(diǎn)。然而，在免疫細(xì)胞中，LAG3下游的信號(hào)通路并不完全清楚，不同細(xì)胞表達(dá)LAG3的功能也不盡相同，激活還是抑制LAG3受體，以及如何準(zhǔn)確靶向LAG3表達(dá)的目的細(xì)胞是值得思考的問(wèn)題。