趙樹龍，劉樂，姜飛，鄧麗華，馬萍，康海全

(徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州221002)

流行性腦脊髓膜炎(epidemic cerebrospinalmeningitis, ECM)簡稱流腦，是由腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis, Nm)引起的急性呼吸道傳染性疾病，具有起病急、病情發(fā)展快和病死率高等特點，常在冬春季節(jié)發(fā)病和流行，尤其以兒童多見[1]。腦膜炎奈瑟菌根據(jù)其莢膜多糖的特點，分為12個血清群(A、B、C、E、H、I、K、L、X、Y、Z和W135)，A、B、C、W135、Y以及Z群是目前主要流行的致病菌群[2]。我國流行性腦脊髓膜炎以A群和C群為主要流行群[2]，B群可引起散發(fā)病例。2021年3月江蘇省徐州市發(fā)現(xiàn)1例青少年流行性腦脊髓膜炎病例，經(jīng)研究分析為C群腦膜炎奈瑟菌引起，現(xiàn)將其病原學和分子分型特征結果報告如下。

1 材料與方法

1.1病歷資料 患者男，12歲，2021年3月24日因為發(fā)熱伴嘔吐1 d，意識模糊8 h，緊急收入徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院。入院時體溫37.5 ℃，昏迷狀態(tài)，精神反應差，全身皮膚未見皮疹出血點，淺表淋巴結未及腫大，扁桃體無腫大、充血，未見膿點及皰疹，呼吸平穩(wěn)，雙肺聽診呼吸音粗，未及明顯干濕啰音，心率約85次/分，心律齊，心音有力，未及明顯雜音，腹軟，肝脾不大，四肢活動自如，肌張力正常，Babinski征：陽性。入院時，血常規(guī)檢測：白細胞總數(shù)38.7×109/L，中性粒細胞比例95.3%，C反應蛋白9.58 mg/L；腦脊液常規(guī)檢測：外觀成乳白色渾濁，蛋白質(zhì)3.48 g/L，白細胞計數(shù)26.3×109/L，葡萄糖2.25 mmol/L，氯化物111.7 mmol/L。入院后病危，予心電監(jiān)護、鼻導管吸氧、床旁隔離，予萬古霉素聯(lián)合頭孢曲松抗感染，丙種球蛋白減輕免疫反應，地塞米松減輕炎癥反應，甘露醇聯(lián)合甘油果糖氯化鈉注射液交替降顱壓，復合輔酶保護臟器及營養(yǎng)支持對癥治療。同時進行腰穿檢查。入院當天采集患者腦脊液標本注入血平板培養(yǎng)，5% CO2、36.5 ℃培養(yǎng)，同時采集雙側(cè)雙瓶血進行血培養(yǎng)。第2天腦脊液培養(yǎng)陰性，血培養(yǎng)提示陽性。將患者血培養(yǎng)陽性培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種血平板，5% CO2、36.5 ℃培養(yǎng)。第3天腦脊液培養(yǎng)血平板與血培養(yǎng)轉(zhuǎn)種血平板均長出菌株。革蘭染色見革蘭陰性雙球菌，為腦膜炎奈瑟菌疑似菌株。后轉(zhuǎn)至傳染病醫(yī)院進一步治療，病例追蹤了解到病人根據(jù)相關的藥敏結果提示，選擇使用青霉素治療后病情明顯好轉(zhuǎn)并已出院。

1.2試劑與儀器 普通血平板、M-H平板、質(zhì)控菌株ATCC 25922、肺炎鏈球菌ATCC 49619(南京便珍生物科技有限公司)；藥敏紙片：青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、美羅培南、阿奇霉素、氯霉素、利福平、米諾環(huán)素、左氧氟沙星、復方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、萘啶酸(英國Oxiod公司)；微生物質(zhì)譜鑒定儀(德國Bruker公司)，2720型PCR擴增儀(美國ABI公司)，CYCP-31CN微型瓊脂糖電泳儀(北京六一儀器廠)，成像分析儀、Powerpac高流電泳儀(美國Bio-Rad公司)，HC-2518高速離心機(安徽中科中佳公司)，DTC-100恒溫金屬浴(杭州瑞誠儀器有限公司)，Golden Easy PCR System(天根生物公司)，ABI 3730XL測序儀(ABI公司)。引物合成和測序均由上海生工生物工程公司完成。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定 將血培養(yǎng)陽性菌株轉(zhuǎn)種血平板，置5% CO2培養(yǎng)箱36.5 ℃培養(yǎng)20 h。對血平板分離菌株進行質(zhì)譜儀鑒定。

1.3.2PCR分型 從血平板上挑取多個菌落混懸于200 μL滅菌蒸餾水中，100 ℃煮沸10 min，冰水浴10 min，12 000 r/min離心1 min，取上清液為PCR反應模板，-20 ℃保存。普通PCR引物參照文獻[3-4]合成，見表1。PCR擴增表1中的目的基因，PCR反應體系和條件按文獻[5]操作。PCR反應體系為25 μL。PCR反應參數(shù)：95 ℃預變性3 min；92 ℃變性 30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，37個循環(huán)；72 ℃延伸40 s。擴增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，于120 V恒壓電泳60 min，凝膠成像儀進行觀察拍照。擴增產(chǎn)物由上海生工進行雙向測序分析，測序引物同PCR分型引物，擴增儀器為ABI 3730XL測序儀。

表1 腦膜炎奈瑟菌PCR分型所需引物序列以及擴增片段長度

1.3.3多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST) MLST分型引物參考PubMLST數(shù)據(jù)庫http://pubmlst.org/neisseria/imformation，用Primer軟件進行設計,見表2。用提取好的腦膜炎奈瑟菌的反應模板，對7個管家基因進行PCR擴增，反應體系和條件同文獻[5]。PCR反應體系為25 μL。PCR反應參數(shù)：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。擴增產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。單一陽性條帶產(chǎn)物由上海生工公司純化后用相應的測序引物(見表2)進行雙向測序，擴增儀器為ABI 3730XL測序儀。測序結果提交到PubMLST數(shù)據(jù)庫，獲取各管家基因的等位基因號，形成該菌株等位基因譜，判斷其序列型(sequence type, ST)及所屬的ST克隆系，方法見文獻[5]。

表2 多位點序列分型引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.3.4藥物敏感試驗 取分純后培養(yǎng) 24 h的腦膜炎奈瑟菌菌株于3 mL無菌生理鹽水中，制備0.5麥氏濁度單位的菌液，均勻涂布在M-H平板上，每個平板粘貼2張抗菌藥物紙片，置36.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h讀取最低抑菌濃度(MIC)。試驗同時用ATCC 49619和ATCC 25922作質(zhì)控。結果判定按照2020年美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦標準[6]報告敏感、中介、耐藥。

2 結果

2.1PCR分型鑒定 血培養(yǎng)標本中分離出的革蘭陰性雙球菌，經(jīng)質(zhì)譜儀鑒定為腦膜炎奈瑟菌。經(jīng)PCR擴增結果顯示，crgA陽性，siaD(C)陽性。見圖1。經(jīng)測序分析后可鑒定為C群腦膜炎奈瑟菌。

2.2MLST分型結果 成功擴增出7個管家基因，見圖2。7個管家基因經(jīng)DNA測序，測序結果經(jīng)過PubMLST數(shù)據(jù)庫比對，獲得7個等位基因號分別為abcZ222、adK3、aroE58、fumC275、gdh30、pghC5、pgm255。該菌株的MLST分型為ST-4821型。

注：M，DNA marker；1，crgA；2，OrF-2；3，siaD(B)；4，siaD(C)；5，siaD(Y)；6，siaD(W135)。

注：M，DNA marker；1，abcZ；2，adk；3，aroE；4，fumC；5，gdh；6，pghC；7，pgm。

2.3藥物敏感性試驗結果 該菌株對青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、美羅培南、阿奇霉素、氯霉素、利福平、米諾環(huán)素、左氧氟沙星、復方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、萘啶酸均敏感。

3 討論

目前，文獻報道發(fā)現(xiàn)，歐美地區(qū)流行性腦脊髓膜炎流行的血清群主要為B群、C群、Y群，非洲流行性腦脊髓膜炎主要流行血清群為W群[7]。2003年以前我國流行性腦脊髓膜炎的流行血清群以A群為主，之后C群逐漸流行，A群自2010年以來病例明顯減少，而出現(xiàn)B群及W群病例的地區(qū)呈增多的趨勢，個別省份出現(xiàn)X群和Y群病例[8]。徐州市在2011年有一篇關于B群腦膜炎奈瑟菌感染導致的腦脊髓膜炎的文獻描述[9]。本次實驗室發(fā)現(xiàn)的腦膜炎奈瑟菌序列型是ST-4821型，同時是我國首次報道并被國際承認的重要流行克隆群，是國際上引起流行性腦脊髓膜炎流行的第7個具有高致病性的C群菌株亞群之一[10]。

據(jù)相關文獻報道，在C群和B群的不同血清群腦膜炎奈瑟菌之間，比較容易發(fā)生莢膜間的轉(zhuǎn)換，同時我國流行性腦脊髓膜炎流行雖然以A群和C群為主[11]，但B群也已相繼出現(xiàn)[11-12]。我國現(xiàn)有的流行性腦脊髓膜炎疫苗有針對A群、A+C群、A+C+W135+Y群的，可針對性預防相應血清群流行性腦脊髓膜炎，但尚無B群疫苗[13]，所以應加強流行性腦脊髓膜炎病原及時監(jiān)測，以便采取針對性的防控措施。

WHO一共推薦了12種抗菌藥物用于臨床流行性腦脊髓膜炎救治和流行性腦脊髓膜炎疫情發(fā)生后的重點人群預防性服藥，根據(jù)相關研究，目前頭孢噻肟、氨芐西林和青霉素作為一線藥物在臨床得到了廣泛使用。全球范圍內(nèi)不斷有青霉素耐藥或不敏感菌株的報道，我國亦出現(xiàn)對青霉素耐藥的腦膜炎奈瑟菌[14]。加強對于頭孢噻肟、氨芐西林等抗菌藥物尤其是青霉素的耐藥性檢測，了解耐藥譜的變化趨勢，對臨床經(jīng)驗用藥具有重要的指導意義。另外，磺胺類藥物如磺胺甲基異噁唑，曾經(jīng)作為臨床救治和預防性服藥首選藥物，但2005年安徽出現(xiàn)C群腦膜炎奈瑟菌，對磺胺類藥物均耐藥，故磺胺類藥物已不再推薦作為臨床救治和預防性服藥的首選藥物。但本次臨床分離出的C群腦膜炎奈瑟菌對臨床常見的抗菌藥物均敏感，包含磺胺類藥物復方磺胺甲噁唑，不同于上述報道。本地區(qū)腦膜炎奈瑟菌的耐藥譜與其他地區(qū)不同的耐藥機制是下一步研究的方向。