王曉梅 姚敏 修小斐 王雅琪 陳婷婷 高峰△

（1. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院病理科，河北 石家莊 050051；2. 河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)研究室，河北 石家莊 050017）

糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，是引起終末期腎功能衰竭的主要原因之一。探討其發(fā)病機(jī)制、尋求有效的防治措施對(duì)廣大糖尿病腎病患者具有重要意義。Notch通路在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制已被證實(shí)[1]。Notch受體在γ-分泌酶的介導(dǎo)下釋放Notch胞內(nèi)域（Notch intracellular domain，NICD）發(fā)揮生物學(xué)作用。Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是KLFs家族成員之一，是一種真核鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，通過激活或抑制其目的基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物過程[2,3]。近年來，KLF4在蛋白尿性腎小球疾病中的作用也逐漸被關(guān)注，但Notch通路在糖尿病腎病進(jìn)展過程中是否存在對(duì)KLF4表達(dá)的調(diào)控，還未被證實(shí)。

本研究在糖尿病小鼠腎組織中檢測(cè)Notch通路和KLF4的表達(dá)情況，并通過抑制Notch通路觀察對(duì)KLF4及足細(xì)胞特異蛋白Nephrin表達(dá)的影響，進(jìn)而探討糖尿病腎病損傷機(jī)制，為DN的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡雄性作為糖尿病模型的db/db小鼠和對(duì)照組的db/m小鼠均購(gòu)自南京大學(xué)模型動(dòng)物研究所。γ-分泌酶抑制劑DAPT 購(gòu)自Sigma公司。兔抗Notch1和NICD1多克隆抗體購(gòu)自Cell signaling公司。兔抗KLF4多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司。兔抗Nephrin多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。小鼠抗β-actin多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。組織RNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司。Real-time PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.2 動(dòng)物模型與分組

選取db/db小鼠作為糖尿病小鼠模型，將糖尿病小鼠分為兩組（n=6），分別為db/db組和db/db+DAPT組。db/db+DAPT組小鼠于第9 w開始每日腹腔注射一次溶于二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）的DAPT10 mg?kg-1，db/db組小鼠每日腹腔注射一次等體積的DMSO，連續(xù)給藥8 w。另選8周齡雄性db/m小鼠作為對(duì)照（n=6）。于第16 w每組取6只小鼠代謝籠收集24 h尿，股動(dòng)脈取血，用于生化指標(biāo)檢測(cè)，取左腎組織4%中性甲醛固定用于免疫組化檢測(cè)，取右腎臟皮質(zhì)放入液氮中，-80°C保存，用于Western blot和Real-time PCR檢測(cè)。

1.3 免疫組化檢測(cè)Nephrin蛋白表達(dá)

將石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2甲醇溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波熱處理修復(fù)抗原，正常小牛血清封閉非特異性抗原，然后分別加入Nephrin（1:50）抗體，4°C孵育過夜。分別加入生物素化二抗和鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶在37°C孵育30 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液，用蘇木精復(fù)染后，將切片脫水并封固。磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）代替一抗，做陰性對(duì)照。

1.4 Western blot檢測(cè)Notch1、NICD1、KLF4、Nephrin蛋白表達(dá)

采用RIPA裂解液含1×PBS，1%乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40，NP-40），0.5%去氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫代硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS），用前加苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）0.1g?L-1）提取腎組織蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，每孔加100 μg總蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉37°C封閉1 h，分別加入兔抗Notch1（1:200）、NICD1（1:500）、KLF4（1:500）、Nephrin（1:500）多克隆抗體和小鼠抗β-actin（1:1000）多克隆抗體4°C過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育2 h；滴加ECL發(fā)光試劑后進(jìn)行拍照。用美國(guó)UVP公司LabWorks 4.5軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，目的蛋白與β-actin光密度值表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Real-time PCR檢測(cè)Notch1、KLF4、Nephrin mRNA表達(dá)

應(yīng)用組織RNA提取試劑盒提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積為20 μL，按照反轉(zhuǎn)錄說明書合成cDNA。

引物分別為：Notch1（118 bp），上游5’- GTG GAT GAC CTA GGC AAG TCG-3’，下游：5’-GTC TCC TCC TTG TTG TTC TGC A-3’；KLF4（243 bp），上游5’-TTC CAA CTC GCT AAC CCA CC-3’，下游5’-TTG ATG TCC GCC AGG TTG AA-3’；Nephrin（190 bp），上游5’-GCT CAG GGA AGA CAG CAA CA-3’，下游5’-GAT AGA GCC CAG AAG CCT CG-3’；18S（151 bp），上游5’-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3’，下游5’-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3’；所有引物均由北京奧科公司合成。Real-time PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性2 min，94°C變性25 s，60°C退火30 s，40個(gè)循環(huán)結(jié)束。由PCR反應(yīng)曲線得到Ct值，18S mRNA作為內(nèi)參，用2△△Ct法分析基因的相對(duì)表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SSD）表示，進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)

與db/m組小鼠相比，db/db組小鼠血糖、尿蛋白和尿素氮明顯升高（P<0.01）；在db/db組小鼠給予DAPT后，尿蛋白和尿素氮明顯下降（P<0.01），但血糖在db/db組和db/db+DAPT組無明顯差異（P>0.05），見表1。

表1 小鼠血糖、尿蛋白、尿素氮比較（±SD，n=6）

表1 小鼠血糖、尿蛋白、尿素氮比較（±SD，n=6）

注：與db/m組比較，**P<0.01；與db/db組比較，##P<0.01。

組別 血糖（mmol?L-1） 尿蛋白（mg?24h-1） 尿素氮（mmol?L-1） db/m組 7.32±0.81 3.42±0.72 8.31±1.14 db/db組 29.76±5.75** 26.15±6.17** 15.24±2.38** db/db+DAPT組 30.15±6.53 20.02±4.72## 12.02±2.10##

2.2 抑制Notch通路對(duì)KLF4和Nephrin蛋白表達(dá)的影響

免疫組化顯示Nephrin在腎組織腎小球細(xì)胞漿表達(dá)，db/db組小鼠Nephrin表達(dá)強(qiáng)度低于db/m組小鼠，DAPT能增加糖尿病小鼠Nephrin蛋白的表達(dá)，見圖1。Western blot檢測(cè)顯示db/db組與db/m組小鼠腎組織相比Notch1和NICD1蛋白表達(dá)增加（P<0.01），應(yīng)用DAPT不能抑制糖尿病小鼠Notch1蛋白表達(dá)的增高（P>0.05），但可抑制NICD1蛋白表達(dá)（P<0.01）；糖尿病小鼠腎組織KLF4和Nephrin蛋白表達(dá)與db/m組相比明顯降低，在給予DAPT抑制Notch通路活化后，KLF4和Nephrin蛋白表達(dá)有所增加（P<0.05或P<0.01），見圖2、表2。

圖1 免疫組化檢測(cè)Nephrin蛋白表達(dá)（×400）

圖2 Western blot檢測(cè)Notch1、NICD1、KLF4和Nephrin蛋白表達(dá)

表2 Western blot檢測(cè)Notch1、NICD1、KLF4和Nephrin蛋白表達(dá)（±SD，n=6）

表2 Western blot檢測(cè)Notch1、NICD1、KLF4和Nephrin蛋白表達(dá)（±SD，n=6）

注：與db/m組比較，**P<0.01；與db/db組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 Notch1 NICD1 KLF4 Nephrin db/m組 0.43±0.03 0.12±0.00 0.23±0.02 0.23±0.03 db/db組 0.65±0.08** 0.92±0.19** 0.09±0.00** 0.08±0.00** db/db+DAPT組 0.69±0.09 0.60±0.11## 0.15±0.00# 0.13±0.01#

2.3 抑制Notch通路對(duì)KLF4和Nephrin mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR檢測(cè)顯示Notch1 mRNA在db/db組小鼠腎組織高于db/m組（P<0.01），在db/db組和db/db+DAPT組Notch1 mRNA表達(dá)無明顯差異（P>0.05）；KLF4和Nephrin mRNA在db/db組比db/m組明顯降低，給予DAPT后KLF4和Nephrin mRNA表達(dá)增加（P<0.01），見表3。

表3 Real-time PCR檢測(cè)Notch1、KLF4和Nephrin mRNA表達(dá)（±SD，n=6）

表3 Real-time PCR檢測(cè)Notch1、KLF4和Nephrin mRNA表達(dá)（±SD，n=6）

注：與db/m組比較，**P<0.01；與db/db組比較，##P<0.01。

組別 Notch1 KLF4 Nephrin db/m組 1.00±0.13 1.00±0.09 1.00±0.15 db/db組 4.85±0.72** 0.39±0.02** 0.43±0.08** db/db+DAPT組 4.69±0.83 0.71±0.07## 0.63±0.07##

3 討論

足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能是維持腎小球蛋白質(zhì)濾過屏障完整性的重要組成部分。Nephrin屬于1型跨膜蛋白，它通過nephrin-nephrin或nephrin-Neph-1相互作用，起到橋接相鄰足突的作用，是裂孔（Slit diaphragm，SD）蛋白復(fù)合體的中心分子。DN發(fā)生時(shí)，細(xì)胞骨架發(fā)生改變，SD蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)破壞，Nephrin表達(dá)降低[4]。本研究結(jié)果也證實(shí)在糖尿病小鼠腎組織Nephrin蛋白及mRNA表達(dá)降低。

Notch通路是一種在進(jìn)化相對(duì)保守的廣泛存在于細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)通路[5]。Notch信號(hào)由受體與配體相互作用而激活，配體誘導(dǎo)Notch受體發(fā)生構(gòu)象改變，先在細(xì)胞外金屬蛋白酶的作用下發(fā)生水解，隨后又在γ-分泌酶的介導(dǎo)下釋放NICD[6]。DAPT作為γ-分泌酶抑制劑只影響NICD1的生成，而對(duì)糖尿病小鼠Notch1蛋白及mRNA表達(dá)的升高無影響。NICD是Notch通路的活化形式，其進(jìn)入細(xì)胞核，影響細(xì)胞分化、增殖和凋亡。在糖尿病小鼠模型及高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中Notch通路存在活化，造成Nephrin表達(dá)減少，蛋白尿增加，細(xì)胞外基質(zhì)生成增多。KLF4是KLFs家族成員之一。Hayashi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在阿霉素（Adriamycin，ADM）誘導(dǎo)的腎病小鼠中，KLF4在腎小球足細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，并且蛋白尿水平顯著升高，當(dāng)在腎病小鼠足細(xì)胞中增加KLF4的表達(dá)可以降低蛋白尿。在糖尿病小鼠腎組織KLF4的表達(dá)明顯下調(diào)，伴隨著Nephrin表達(dá)下降，蛋白尿增加。

已有研究證實(shí)，Notch通路抑制KLF4表達(dá)促進(jìn)肝組織纖維化，運(yùn)用DAPT抑制Notch通路活化后KLF4蛋白表達(dá)增加[8]。在人膀胱癌細(xì)胞中抑制Notch1表達(dá)后，KLF4表達(dá)也增加，癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖被抑制，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期，細(xì)胞凋亡增加[9]。Notch通路通過調(diào)節(jié)KLF4表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，同時(shí)KLF4的缺失可改變腫瘤血管的表型，增加腫瘤轉(zhuǎn)移的幾率[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在在糖尿病小鼠腎組織Notch1和NICD1表達(dá)增加，存在Notch通路的激活。應(yīng)用DAPT抑制Notch通路激活后，能緩解糖尿病小鼠腎組織KLF4表達(dá)的降低，進(jìn)而增加Nephrin表達(dá)，改善腎臟功能，減輕蛋白尿和尿素氮。結(jié)果提示在糖尿病小鼠腎組織中，Notch通路可調(diào)控KLF4和Nephrin表達(dá)，參與糖尿病腎病進(jìn)展過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，Notch通路和KLF4在腎臟發(fā)育過程中共同參與調(diào)節(jié)特定節(jié)段腎單位和單個(gè)細(xì)胞的分化[11]。 在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷過程中，Notch通路和KLF4可能協(xié)同調(diào)控足細(xì)胞固有蛋白表達(dá)。