溫澤宇，于大永，王 柳，史麗穎

（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連116622）

Wnt信號通路是由配體蛋白質(zhì)Wnt與膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在胚胎發(fā)育和多種癌癥的形成過程中起著至關(guān)重要的作用[1].在Wnt通路中，β-catenin裂解復(fù)合物是一種重要的調(diào)節(jié)因子，由Adenomatous polyposis coli（APC）、軸抑制蛋白（axin）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）和酪蛋白激酶1α（CK1α）組成，它嚴(yán)格控制著β-catenin的水平[2].在Wnt信號沒有被激活的情況下，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin保持在較低水平.在大多數(shù)癌細(xì)胞中可觀察到Wnt信號通路被異常激活，β-catenin裂解復(fù)合物發(fā)生降解，使得β-catenin積累并且移位到細(xì)胞核中[3-4].Axin蛋白是Wnt信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，可降低β-catenin的水平，抑制Wnt通路基因轉(zhuǎn)錄.有研究報(bào)道[5-8]，端錨聚合酶（tankyrase，TANKS）可以降低Axin蛋白的表達(dá)量，它是多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）家族的一員.端錨聚合酶抑制劑可使Axin蛋白積累，進(jìn)而降解β-catenin，阻止其向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)并降低Wnt通路基因的表達(dá)[9].端錨聚合酶能夠以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）為底物，生成附著在靶蛋白上的ADP-核糖聚合物.TANK1和TANK2是端錨聚合酶的2個(gè)異構(gòu)體，蛋白序列高度保守，同源性高達(dá)80%[10-11].同PARP家族其他成員類似，端錨聚合酶的催化結(jié)構(gòu)域由1個(gè)結(jié)合并水解NAD+的供體位點(diǎn)和1個(gè)容納目標(biāo)蛋白的受體位點(diǎn)組成，供體部位含有煙酰胺位點(diǎn)和腺苷位點(diǎn)[12-13].供體位點(diǎn)構(gòu)象的特征是封閉且靈活，當(dāng)供體位點(diǎn)與NAD+或抑制劑結(jié)合時(shí)，端錨聚合酶D環(huán)上具有靈活構(gòu)象的氨基酸被動發(fā)生移位，允許NAD+或抑制劑進(jìn)入溝槽[14-15].自20世紀(jì)70年代以來，許多研究[16-18]發(fā)現(xiàn)，在PARP家族成員中高度保守的煙酰胺位點(diǎn)是端錨聚合酶抑制劑（如xav939）作用的唯一靶點(diǎn).最近研究發(fā)現(xiàn)[19]，一種新型的抑制劑（IWR1）可結(jié)合在TANK1的腺苷口袋中，與結(jié)合口袋周圍氨基酸的作用方式相比于其他PARP家族成員較為保守，表明此類抑制劑對端錨聚合酶具有很高的選擇性.腺苷口袋是由α3螺旋和D環(huán)上的氨基酸Phe1188運(yùn)動產(chǎn)生的，定義腺苷口袋的結(jié)構(gòu)特征和結(jié)合模式對于開發(fā)高選擇性且強(qiáng)效的端錨聚合酶抑制劑具有重要指導(dǎo)意義.

為了深入了解端錨聚合酶腺苷位點(diǎn)處抑制劑的作用方式，本研究從文獻(xiàn)[12-15，20-21]中選取活性和非活性抑制劑組成訓(xùn)練集和測試集，訓(xùn)練集用來構(gòu)建基于配體共同特征的藥效團(tuán)模型，測試集用來驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性.將活性抑制劑對接于腺苷結(jié)合位點(diǎn)，研究活性抑制劑的作用模式，對比分析關(guān)鍵氨基酸與活性抑制劑的普遍作用模式.將分子對接結(jié)果與藥效團(tuán)模型結(jié)合，進(jìn)一步構(gòu)建更精確的藥效團(tuán)模型，反映抑制劑對腺苷位點(diǎn)的關(guān)鍵作用方式以及作用模式.該藥效團(tuán)模型可用于端錨聚合酶抑制劑的開發(fā)和篩選.

1 材料與方法

1.1 小分子的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[12-14，20]，選擇15種端錨聚合酶抑制劑作為訓(xùn)練集，構(gòu)建基于配體共同特征的藥效團(tuán)，15種抑制劑的結(jié)構(gòu)如圖1所示，其活性如表1所示.

表1 訓(xùn)練集中抑制劑的活性Tab.1 Activity of the inhibitors in the training set

圖1 訓(xùn)練集中抑制劑的結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular schematics of the inhibitors in the training set

這些小分子結(jié)構(gòu)用SYBYL6.9.1中的Steepest Descent算法進(jìn)行疊加和優(yōu)化，然后采用共軛梯度和牛頓-拉夫森算法優(yōu)化，收斂梯度分別為0.4、0.04和0.004 kJ/mol[22].隨機(jī)選用抑制劑1、5、7、9、11和13進(jìn)行分子對接實(shí)驗(yàn).

1.2 共同特征藥效團(tuán)的建模和驗(yàn)證

以15種抑制劑作為訓(xùn)練集，在InsightⅡ軟件中，利用HipHop模塊生成基于配體共同特征的藥效團(tuán).在參數(shù)設(shè)置上，選擇氫鍵供體（D）、氫鍵受體（A）、疏水基團(tuán)（H）、共軛環(huán)（R）和正電離中心（P）5個(gè)特征.設(shè)置藥效團(tuán)的構(gòu)象最多生成數(shù)為10.此外，參考訓(xùn)練集的活性數(shù)據(jù)，設(shè)置“Principal”值為2，“MaxOmitfeat”值為1，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值.

在Ligand Profiler模塊中，通過由11個(gè)活性端錨聚合酶抑制劑和6個(gè)非活性抑制劑組成的測試集驗(yàn)證藥效團(tuán)，測試集化合物的活性如表2所示.為了將測試集的所有配體與藥效團(tuán)匹配，設(shè)置maximum omitted features為0，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù).

表2 測試集中抑制劑的活性Tab.2 Activity of the inhibitors in the test set

1.3 蛋白準(zhǔn)備

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/）下載TANK1（PDB：4K4F）[23]的晶體結(jié)構(gòu).利用Schrodinger軟件刪除蛋白中的水分子，加入晶體結(jié)構(gòu)缺失的氫原子和氨基酸殘基，在pH值為7.4的環(huán)境下，對氨基酸的質(zhì)子化帶電狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié).通過原子力場OPLS2005，將晶體結(jié)構(gòu)的氫原子能量最小化.

1.4 分子對接

分別利用Glide、AutoDock 4.2和AutoDock Vina 1.1軟件，將訓(xùn)練集中的15個(gè)小分子抑制劑與TANK1蛋白對接.以晶體結(jié)構(gòu)中天然配體的位置為活性中心，坐標(biāo)位置：x=-8.89，y=41.75，z=27.93.在AutoDock中，設(shè)置活性位點(diǎn)口袋大小為4 nm×4 nm×40 nm.利用Glide中的SP和XP這2種對接精度進(jìn)行對接.

2 結(jié)果與分析

2.1 共同特征藥效團(tuán)

以15種端錨聚合酶抑制劑為訓(xùn)練集，利用HipHop模塊生成基于配體共同特征的藥效團(tuán)，結(jié)果如表3所示.藥效團(tuán)假設(shè)大致可分為4類：RHAAA（01、02、03）、HHAAA（04、05、06）、RHHAA（07、08、10）、RRHHA（09）.產(chǎn)生的10個(gè)藥效團(tuán)得分范圍為177.785~193.601.

表3 由HipHop模塊生成的共同特征藥效團(tuán)Tab.3 Pharmacophore based on the common features generated by the HipHop

2.2 驗(yàn)證藥效團(tuán)模型

為了獲得更準(zhǔn)確的藥效團(tuán)，利用測試集對藥效團(tuán)進(jìn)行測試.將測試集映射到藥效團(tuán)上，得到了1個(gè)熱度圖，如圖2（a）所示.測試集和藥效團(tuán)的擬合值可以用熱度圖中的顏色條表示：藍(lán)色代表低擬合值，綠色代表中等擬合值，黃色、橙色和紅色代表高擬合值，黑色和白色分別代表最低擬合值和最高擬合值.根據(jù)對熱度圖結(jié)果的分析，在假設(shè)8（Hyp08）中，活性抑制劑A1—A11的擬合值高于非活性抑制劑B1—B6的擬合值.假設(shè)8的結(jié)構(gòu)如圖2（b）所示.

圖2 測試集對藥效團(tuán)的測試結(jié)果Fig.2 Test result of the test set against pharmacophore models

為了進(jìn)一步研究構(gòu)效關(guān)系，從訓(xùn)練集中選擇了6種抑制劑（抑制劑1、3、5、9、10和14）映射到假設(shè)8，結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看出，大多數(shù)抑制劑可以與藥效團(tuán)模型相匹配，其中，吡咯和苯環(huán)映射到共軛環(huán)（R）特征，疏水基團(tuán)（H1和H2）與苯環(huán)和環(huán)己烷相匹配，氫鍵受體（A1和A2）與羰基、吡啶、三唑烷和乙腈匹配.抑制劑5和抑制劑9與氫鍵受體（A1）不匹配.該藥效團(tuán)模型能夠反映出抑制劑的結(jié)構(gòu)特征，但未考慮抑制劑在蛋白質(zhì)活性部位的構(gòu)象因素，因此還需要用分子對接結(jié)果優(yōu)化該藥效團(tuán)模型.

圖3 藥效團(tuán)特征在6個(gè)具有代表性的抑制劑上的2D映射Fig.3 2D mapping of the pharmacophore features onto the six representative inhibitors

2.3 分子對接

用4種不同的對接方法將15種抑制劑與TANK1（PDB：4K4F）腺苷位點(diǎn)對接.首先對方法進(jìn)行評價(jià)，分別利用4種對接方法將TANK1與天然配體進(jìn)行對接.將對接后的天然配體與原天然配體構(gòu)象進(jìn)行比較，分析兩者之間的均方根偏差（RMSD）.4種對接結(jié)果的RMSD值：AutoDock為0.633 nm，AutoDockVina為0.537 nm，Glide SP為0.486 nm，Glide XP為0.436 nm.RMSD值均低于2 nm，因此認(rèn)為4種對接方法均合理.分別利用4種對接方法將15種抑制劑與TANK1腺苷位點(diǎn)對接，結(jié)果如表4所示.將4種對接軟件的對接分?jǐn)?shù)值同活性數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，與AutoDock和AutoDockVina相比，Glide對接程序的對接數(shù)據(jù)與活性數(shù)據(jù)的相關(guān)性更高.在對接模擬過程中，Glide XP的對接精度設(shè)置優(yōu)于SP，因此，在后續(xù)的作用方式研究中，選取Glide XP對接構(gòu)象進(jìn)行研究.

表4 不同軟件的對接結(jié)果Tab.4 Summary of the docking results in different software（kJ/mol）

為了進(jìn)一步分析抑制劑與端錨聚合酶的結(jié)合方式，將部分抑制劑（1、3、5、9、13）疊合在腺苷位點(diǎn)上，結(jié)果如圖4所示.抑制劑的骨架符合腺苷位點(diǎn)的形狀，深入占據(jù)了腺苷口袋的A、B、C 3個(gè)位點(diǎn).TANK1的活性位點(diǎn)如圖5所示.從訓(xùn)練集中選擇抑制劑1、5、7、9、11和13與TANK1進(jìn)行互作模式分析，抑制劑與TANK1活性部位對接的結(jié)果如圖6所示.

圖4 TANK1抑制劑于腺苷活性口袋處排列的三維視圖Fig.4 Three-dimensional view of the TANK1 inhibitors arranged in the adenosine active pocket

圖5 TANK1活性位點(diǎn)示意圖Fig.5 Schematic representation of the TANK1 active site

抑制劑1與腺苷位點(diǎn)的相互作用如圖6（a）所示.在A位點(diǎn)處，惡唑啉酮上的羰基與Tyr 1213形成氫鍵，Phe 1208、Tyr 1203和Ile 1228與惡唑啉酮上的甲基和苯環(huán)形成疏水作用，Phe 1188與苯環(huán)形成π-π共軛作用.在C位點(diǎn)處，Asp1 198和Gly 1196分別與酰胺上的羰基和喹啉6位的—CH形成氫鍵.喹啉與其對立位置D環(huán)上的His 1201形成π-π共軛作用.

在C位點(diǎn)處，抑制劑9、11和13（圖6（b）、圖6（c）、圖6（d））與抑制劑1不同，它們以更穩(wěn)定的基團(tuán)取代氨基喹唑啉酰胺，這些基團(tuán)與Asp 1198和Gly 1196形成氫鍵.抑制劑9和抑制劑11的嘧啶以及抑制劑13的苯環(huán)都與D環(huán)上的His 1201形成共軛作用.抑制劑11和抑制劑13含有環(huán)己烷，而抑制劑9含有苯環(huán)，在B位點(diǎn)處的對接構(gòu)象顯示，抑制劑9中心的苯環(huán)垂直于吡啶環(huán)，這種特殊構(gòu)象能夠使抑制劑的吡啶深入填充到由TANK1的Ser 1186、Phe 1188和Ala 1202形成的疏水溝槽中，形成更強(qiáng)的疏水作用.

圖6 抑制劑與TANK1活性部位的對接Fig.6 Docking of inhibitors into the active site of TANK1

抑制劑5和抑制劑7（圖6（e）和圖6（f））與其他抑制劑的構(gòu)象差異顯著，但在A和C位點(diǎn)處，仍可以觀察到三唑胺和惡唑上的氮原子與Tyr 1213和Asp 1198形成氫鍵，苯環(huán)與D環(huán)上的Phe 1188和His 1201形成共軛作用.在A位點(diǎn)處，TANK1 apo結(jié)構(gòu)上Tyr1213的苯環(huán)與抑制劑甲氧基苯中的苯環(huán)重疊，這種構(gòu)象可能會增加抑制劑的效力.

2.4 建立腺苷位點(diǎn)內(nèi)的相互作用模型

基于配體共同特征生成的藥效團(tuán)模型假設(shè)08被映射到6種抑制劑上，除抑制劑5和抑制劑9外，其余4種抑制劑與藥效團(tuán)特征相匹配.觀察藥效團(tuán)模型與抑制劑的匹配情況，發(fā)現(xiàn)藥效團(tuán)模型與分子對接結(jié)果不能完全匹配.用分子對接結(jié)果對藥效團(tuán)模型進(jìn)行評價(jià)，可以獲得更準(zhǔn)確的藥效團(tuán)模型.總結(jié)分子對接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制劑在腺苷位點(diǎn)處的結(jié)合模式較保守：抑制劑與A位點(diǎn)上的Tyr1213、C位點(diǎn)上的Asp1198和Gly 1196形成3個(gè)關(guān)鍵的氫鍵，在C位點(diǎn)處，抑制劑與對立位置的His 1201形成共軛作用.在藥效團(tuán)模型假設(shè)08（RHHAA）的5個(gè)特征中，氫鍵受體特征都在C位處，同時(shí)缺失能與D環(huán)上His 1201形成共軛作用的特征.

為了獲得更準(zhǔn)確的藥效團(tuán)，將與TANK1對接后的抑制劑疊合起來，保持其在活性部位的構(gòu)象，將這些抑制劑分為2組：抑制劑1~8為第1組，抑制劑9~15為第2組.使用相同的參數(shù)設(shè)置構(gòu)建藥效團(tuán).第1組藥效團(tuán)包含6個(gè)特征，得分范圍為100.868~121.789，新模型中假設(shè)f（RHHAA）具有最佳的相關(guān)性；第2組藥效團(tuán)包含5個(gè)特征，得分范圍為55.643~73.967，假設(shè)a（RHHDA）具有最佳的相關(guān)性.將2個(gè)藥效團(tuán)疊加，得到了精確的藥效團(tuán)模型（RRHHAAD），如圖7所示.

圖7 精確藥效團(tuán)假說在TANK1活性位點(diǎn)上的疊加Fig.7 Superimposition of the refined pharmacophore hypothesis onto the TANK1 active sites

在該藥效團(tuán)中，3個(gè)保守氫鍵特征分布在腺苷口袋的A和C位點(diǎn)處，這與分子對接實(shí)驗(yàn)得到的保守結(jié)合模式一致；2個(gè)共軛環(huán)（R1和R2）特征分別定義在A和C位點(diǎn)處，與Phe 1188和His 1201形成共軛作用；腺苷位點(diǎn)的中心（B位點(diǎn)）處有1個(gè)關(guān)鍵的疏水特征（H2）；另外，模型還有2個(gè)氫鍵受體特征（A1和A2）和1個(gè)氫鍵供體特征（D）.這些關(guān)鍵特征在提高抑制劑的活性和穩(wěn)定性方面起著至關(guān)重要的作用，疊加后得到的藥效團(tuán)可以準(zhǔn)確反映腺苷位點(diǎn)的特征，也可以解釋抑制劑與端錨聚合酶的互作方式.

3 結(jié)論

本研究選取了15種端錨聚合酶抑制劑，先根據(jù)抑制劑的共同特點(diǎn)生成了具有5個(gè)特征的藥效團(tuán)假設(shè)08（RHHAA）：2個(gè)疏水特征、1個(gè)芳香環(huán)、2個(gè)氫鍵受體.隨后從訓(xùn)練集中選擇了6種抑制劑映射到藥效團(tuán)上，發(fā)現(xiàn)有2種抑制劑與藥效團(tuán)模型不匹配.將15種活性抑制劑與TANK1對接，分析分子對接結(jié)果，推測抑制劑若能夠占據(jù)B位點(diǎn)與周圍氨基酸殘基形成廣泛的疏水相互作用，同時(shí)與Tyr 1213、Asp 1198和Gly 1196形成氫鍵，則具有良好的活性.將分子對接結(jié)果與藥效團(tuán)假設(shè)08進(jìn)行比較，結(jié)果顯示分子對接結(jié)果與藥效團(tuán)假設(shè)08特征不能完全匹配.為了獲取更加精準(zhǔn)的藥效團(tuán)模型，以分子對接產(chǎn)生的抑制劑構(gòu)象為基礎(chǔ)，將15種抑制劑分為2組，根據(jù)基于配體共同特征生成的藥效團(tuán)，對比藥效團(tuán)假設(shè)08的化學(xué)特征以及各特征位置，保留藥效團(tuán)08原有特征并融合新構(gòu)建的藥效團(tuán)模型特征，最終得到了一個(gè)更加優(yōu)化的藥效團(tuán)（RRHHAAD）.在該藥效團(tuán)中，3個(gè)保守氫鍵特征分布在腺苷口袋的A和C位點(diǎn)處，2個(gè)共軛環(huán)（R1和R2）特征分別定義在A和C位點(diǎn)處，與端錨聚合酶的Phe1188和His1201形成共軛作用；腺苷位點(diǎn)的中心（B位點(diǎn)）處有1個(gè)關(guān)鍵的疏水特征（H2）；另外，模型中還有2個(gè)氫鍵受體特征（A1和A2）和1個(gè)氫鍵供體特征（D）.該藥效團(tuán)與分子對接結(jié)果一致，能更好地反映端錨聚合酶腺苷活性位點(diǎn)的特征.