范明江，閆魯霞，徐 蕾，張 園，熊廷川，朱長軍

（1.新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆維吾爾自治區(qū) 喀什844000；2.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；3.天津師范大學(xué) 天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；4.新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)院（附屬腫瘤醫(yī)院）腫瘤防治研究所，烏魯木齊830011）

基因組不穩(wěn)定是腫瘤細胞的重要標(biāo)志，引起基因組不穩(wěn)定的原因是細胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制以及DNA損傷修復(fù)分子通路中的相關(guān)蛋白發(fā)生突變或者錯誤表達導(dǎo)致的基因功能異常[1].P53基因是一種廣譜的腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物P53具有調(diào)節(jié)細胞生長、凋亡和DNA修復(fù)的作用.P53結(jié)合蛋白1（p53 binging protein，53BP1）能夠與P53相互結(jié)合，其基因定位在人15號染色體長臂1區(qū)5帶~2區(qū)1帶，全長6.6 kb，編碼1 972個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為217×103[2].53BP1可在修復(fù)DNA雙鏈斷裂損傷（DSB）途徑中發(fā)揮重要作用.Li等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在DSB發(fā)生后第一時間53BP1可被蛋白激酶ATM磷酸化且聚集在DNA損傷處，ATM磷酸化的53BP1持續(xù)聚集在DNA損傷位點，能夠阻止DNA雙鏈損傷的正常同源重組修復(fù)，最終引起細胞基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生.

乳腺癌是一種常發(fā)生于乳腺上皮組織的的婦科惡性腫瘤[4].按照乳腺癌細胞表面雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、表皮生長因子2受體（HER-2）等表達的不同，可將乳腺癌分為Luminal A、Luminal B、HER2陽性和三陰性等類型.Luminal A型乳腺癌的特點為：ER+、和/或PR+、HER2-，與其他類型乳腺癌相比較，Luminal A型乳腺癌預(yù)后相對較好.Luminal B型乳腺癌的特點為：ER+、和/或PR+、HER2+，Luminal B型乳腺癌腫塊大，組織學(xué)分級高，易發(fā)生脈管轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.HER2過表達型乳腺癌的特點為：ER-、PR-、HER2+，該亞型乳腺癌所占比例約為20%.三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的特點為：ER-、PR-、HER2-，該亞型乳腺癌所占比例為15%~20%[5].乳腺癌種類繁多，危害極大，但目前臨床上仍缺少特異性早期分子診斷的方法.

本研究通過制備特異性抗磷酸化53BP1血清，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合蛋白免疫印跡雜交實驗、細胞免疫熒光染色等方法，對抗磷酸化53BP1抗體的特異性進行檢測驗證，以期揭示磷酸化53BP1抗體與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

根據(jù)磷酸化53BP1蛋白分子一級結(jié)構(gòu)中的第25位和第29位氨基酸設(shè)計制備磷酸化53BP1抗體的抗原多肽CIEDpSQPEpSQVLEDD，由杭州丹港生物科技有限公司合成；通用型免疫組化試劑盒，武漢博士德生物公司；乳腺癌組織芯片，上海卓灝醫(yī)藥科技有限公司（芯片編號：BRC2281）.

1.2 實驗方法

1.2.1 磷酸化53BP1抗體制備

磷酸化53BP1抗體由實驗室自主制備，經(jīng)蛋白免疫共沉淀（IP）、免疫印跡雜交（WB）、免疫熒光染色（IF）驗證了抗體的特異性[6].

1.2.2 免疫組化染色檢測

應(yīng)用通用型免疫組化試劑盒進行免疫組化染色實驗.首先是烘片，將石蠟切片放置在60℃烘箱中烘片至少60 min，之后在二甲苯中進行脫蠟處理，將脫蠟好的石蠟切片依次完全浸入不同濃度的乙醇中進行水化處理，然后使用EDTA修復(fù)液進行修復(fù)，用PBS漂洗修復(fù)好的石蠟切片3次，每次5 min.使用3%的雙氧水完全浸沒石蠟切片，室溫下避光封閉30 min，再加PBS漂洗石蠟切片3次，每次5 min.使用0.1%PBST配制的5%BSA抗原封閉液，室溫封閉60 min，封閉內(nèi)源性抗原.接著一抗孵育，加適量磷酸化53BP1抗血清（1∶1000）于組織切片上，4℃條件下過夜，然后用PBS漂洗3次，每次5 min.滴加適量HRP標(biāo)記過的二抗工作液，室溫孵育60 min.將DAB顯色液滴加至甩干的石蠟組織上，蘇木精復(fù)染，將潤洗過的石蠟切片沒入蘇木精染液中.之后按下列步驟進行組織脫水：70%乙醇5 min，85%乙醇5 min，90%乙醇5 min，95%乙醇5 min，100%乙醇10 min，100%乙醇10 min.最后滴加適量的中性樹脂封片，掃描石蠟組織切片并保留樣品染色圖像.

1.2.3 免疫組化染色結(jié)果分析

利用Image scope X64軟件采集免疫組化的圖像，應(yīng)用Image-Pro Plus熒光分析軟件對圖像進行分析.根據(jù)熒光染色的深淺，即光密度值（OD）以及分布面積大小來確定目標(biāo)蛋白的量，將圖片上各點的光密度值累加起來，除以目標(biāo)分布區(qū)域的面積，得到平均光密度值（IOD）.通過計算IOD值的大小，對各樣品的圖像進行定量分析.與人工計數(shù)法相比，該方法不僅能夠提高定量分析的精確度，還可以避免觀察者主觀因素的干擾，重復(fù)性好，可信度高[7].

1.2.4 生物統(tǒng)計結(jié)果分析

采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過獨立樣本T檢驗，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）.

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸化53BP1在乳腺癌組織芯片中的免疫組織化學(xué)染色

通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，應(yīng)用特異性磷酸化53BP1抗血清對乳腺癌組織芯片進行免疫組織化學(xué)染色，染色結(jié)果如圖1所示.其中，A1~A8是8例非惡性癌的乳腺組織（non-cancer，NC），其余為220例乳腺癌組織（tumour）.由于A19、F15、F19、I6、K8樣本嚴(yán)重脫片，沒有采集到滿意圖像，因此這5例病例均未放入結(jié)果統(tǒng)計范圍中.

圖1 磷酸化53BP1在乳腺癌組織芯片中的免疫組織化學(xué)染色Fig.1 Immunohistochemical staining of phosphorylated 53BP1 in breast cancer tissue microarrays

2.2 磷酸化53BP1在乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達情況的比較

利用Image-Pro Plus分別計算抗磷酸化53BP1抗體在220個乳腺癌組織和8例非癌乳腺組織中染色的平均光密度值，IOD大小代表組織標(biāo)本中磷酸化53BP1的表達量.采用獨立樣本T檢驗分析數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖2（a）所示，磷酸化53BP1在乳腺癌組織標(biāo)本中的平均表達量為（0.079±0.027），顯著高于非癌乳腺組織標(biāo)本中的平均表達量（0.036±0.007）.通過獨立樣本T檢驗證實，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）.隨機選取非癌乳腺組織與癌組織染色結(jié)果進行比較，如圖2（b）所示，癌組織中目標(biāo)蛋白的棕色顏色更加明顯.

圖2 磷酸化53BP1在乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達Fig.2 Expression of phosphorylated 53BP1 in breast cancer tissues and non-cancer tissues

2.3 磷酸化53BP1在不同TNM分期乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達情況的比較

利用上述磷酸化53BP1的染色結(jié)果并結(jié)合病例的TNM分期資料（Ⅰ期的病例數(shù)目為20例，Ⅱ期的病例數(shù)目為141例，Ⅲ期的病例數(shù)目為37例，無Ⅳ期的病例），分析不同TNM分期中磷酸化53BP1在乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達差異，結(jié)果如圖3（a）所示.選取TNM分期中典型乳腺癌組織與非癌乳腺組織的染色圖片進行觀察比較，結(jié)果如圖3（b）所示.磷酸化53BP1在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期癌組織標(biāo)本中的平均表達量分別為（0.080±0.019）、（0.078±0.025）和（0.084±0.035），在非癌組織標(biāo)本中的平均表達量為（0.036±0.007）.經(jīng)獨立樣本T檢驗證實，磷酸化53BP1在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期癌組織中的平均表達量均顯著高于非癌組織中的平均表達量，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）.

圖3 磷酸化53BP1在不同TNM分期乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達Fig.3 Expression of phosphorylated 53BP1 in different TNM stages of breast cancer tissues and non-cancer tissues

2.4 磷酸化53BP1在不同病理分級乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達情況的比較

乳腺癌組織芯片中組織病理分級：I級的病例數(shù)目為7例，Ⅰ-Ⅱ級的病例數(shù)目為8例，Ⅱ級的病例數(shù)目為82例，Ⅱ-Ⅲ級的病例數(shù)目為89例，Ⅲ級的病例數(shù)目為22例，因Ⅰ級、Ⅰ-Ⅱ級的病例數(shù)目較少，將其合并分析.不同病理分級乳腺癌組織中磷酸化53BP1的表達與非癌乳腺組織中的表達差異如圖4（a）所示.選取典型的不同病理分級乳腺癌組織染色圖像與非癌組織的圖像進行比較，結(jié)果如圖4（b）所示.在Ⅰ和Ⅰ-Ⅱ級癌組織標(biāo)本中磷酸化53BP1的平均表達量為（0.072±0.029），在Ⅱ級癌組織標(biāo)本中表達量為（0.081±0.023），在Ⅱ-Ⅲ級癌組織標(biāo)本中的表達量為（0.079±0.028），在Ⅲ級癌組織標(biāo)本中的表達量為（0.082±0.025）；非癌組織中的表達量為（0.036±0.007）.經(jīng)獨立樣本T檢驗，在Ⅰ和Ⅰ-Ⅱ級、Ⅱ級、Ⅱ-Ⅲ級和Ⅲ級癌組織中，磷酸化53BP1的平均表達量均顯著高于非癌組織中的表達量，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）.

圖4 磷酸化53BP1在不同病理分級乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達Fig.4 Expression of phosphorylated 53BP1 in different pathological grades of breast cancer and non-cancer tissues

2.5 磷酸化53BP1在不同類型乳腺癌組織與非癌乳腺組織中表達情況的比較

按照乳腺癌組織中雌激素受體、孕激素受體、表皮生長因子2受體等表達的不同，可將乳腺癌分為Luminal A、Luminal B、HER2陽性和三陰性乳腺癌，將不符合ER、PR、HER-2表達檢測指標(biāo)的乳腺癌患者歸結(jié)為其他類型.結(jié)合病歷資料分析可知，220例乳腺癌組織中，Luminal A病例數(shù)目為55例，Luminal B病例數(shù)目為25例，HER2陽性病例數(shù)目為48例，三陰性乳腺癌病例數(shù)目為26例，其他類型的乳腺癌病例數(shù)目為66例.利用磷酸化53BP1的染色結(jié)果并結(jié)合病例資料，分析不同類型的乳腺癌組織與非癌組織中磷酸化53BP1的表達，結(jié)果如圖5（a）所示.選取典型的不同類型乳腺癌組織染色圖片與非癌組織染色圖片進行對比，結(jié)果如圖5（b）所示.磷酸化53BP1蛋白在Luminal A型、Luminal B型、HER2陽性、三陰性以及其他類型乳腺癌組織標(biāo)本中的平均表達量分別為（0.086±0.029）、（0.078±0.028）、（0.077±0.020）、（0.079±0.031）、（0.074±0.027）；在非癌組織中的平均表達量為（0.036±0.007）.經(jīng)獨立樣本T檢驗證實，磷酸化53BP1在不同類型的乳腺癌組織中的表達量均顯著高于非癌組織中的表達量，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）.

圖5 磷酸化53BP1在不同類型乳腺癌組織與非癌乳腺組織中的表達Fig.5 Expression of phosphorylated 53BP1 in different types of breast cancer tissues and non-cancer tissues

3 討論與結(jié)論

細胞在生長增殖等正常生命活動過程中，常常發(fā)生遺傳物質(zhì)DNA的雙鏈斷裂損傷（DSB）.如果DSB不能正常修復(fù)，除引起細胞死亡外，還可能引起細胞基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展.真核細胞有2種主要的修復(fù)途徑應(yīng)對DSB損傷：同源重組修復(fù)（homologous recombination，HR）和非同源末端連接（non-homologous end-joining，NHEJ）.HR需要同源DNA序列作為模板進行修復(fù)，而NHEJ直接連接被切斷的DNA受損的末端[8].當(dāng)細胞發(fā)生DSB時，在DNA損傷位點處蛋白激酶ATM被活化，進而使聚集在此區(qū)域的53BP1發(fā)生磷酸化.磷酸化的53BP1與RIF1結(jié)合形成復(fù)合物聚集在DSB處，抑制細胞進行同源重組修復(fù)[9].此時，乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）通過激活下游底物PP4C（protein phosphatase 4 catalytic subunit）等促進磷酸化的53BP1發(fā)生去磷酸化.去磷酸化的53BP1蛋白與RIF1分離，促使斷裂的DNA以未損傷的姐妹染色單體的同源序列作為修復(fù)模板，進行DNA同源重組修復(fù)，最終保證細胞基因組的完整性[10].如果由各種原因?qū)е翫SB位點的53BP1持續(xù)處于磷酸化狀態(tài)，將抑制細胞同源重組修復(fù)的正常進行，導(dǎo)致細胞基因組不穩(wěn)定，引起腫瘤發(fā)生.

本研究通過對220例乳腺癌組織中53BP1蛋白的磷酸化水平進行免疫組化檢測，利用Image-Pro Plus熒光分析軟件對圖像進行分析，發(fā)現(xiàn)磷酸化53BP1在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于非癌對照乳腺組織中的表達水平，在不同TNM分期、病理分級以及不同類型的乳腺癌組織中的平均表達量均顯著高于非癌對照乳腺組織中的表達量（P＜0.001）.這些結(jié)果表明，磷酸化53BP1與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是一個潛在的能反映乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子標(biāo)志物，可應(yīng)用于早期乳腺癌的篩查和診斷.