劉 剛，任國臣，楊曉萍

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000)

目前慢性腎臟病在人群中的發(fā)病率逐年升高，我國成人人群中慢性腎臟病患病率為10.8%[1-2]。慢性腎臟病已成為嚴重危害人類健康的公共問題，患者的治療耗費了巨額的醫(yī)療資源，給家庭和社會造成了沉重的負擔。研究表明，活性維生素D3具有抑制腎小球系膜細胞增殖，促進細胞凋亡的作用，許多凋亡基因參與了腎小球系膜細胞凋亡，其中以Bcl-2為代表的一組凋亡調(diào)節(jié)基因?qū)毎蛲銎鹬陵P重要的作用[3-5]。為進一步深入探討活性維生素D3對系膜細胞的作用機制，本實驗觀察了活性維生素D3對體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，以期為其臨床運用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1細胞株與試劑 人腎小球系膜細胞株(湘雅醫(yī)學院中心實驗室提供)。磷酸酶抑制劑、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物公司)，胞質(zhì)胞核蛋白提取試劑盒(南京凱基生物公司)，蛋白Marker(北京全式金生物公司)，兔多抗GAPDH(杭州賢至生物公司)，兔單抗Bcl-2(CST)，兔多抗Bax(武漢三鷹生物公司)，細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)2D3，Sigma公司]，MEM粉劑(GIBCO公司)。

1.2儀器與設備 超凈工作臺(蘇州集團安泰空氣技術(shù)有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，低速離心機(Eppendorf)，流式細胞儀(Beckmancoulter)，酶標儀(Thermo)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 將人腎小球系膜細胞從液氮中取出，復溫后用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基在37 ℃、 5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。細胞密度達80%時，加入1～2 mL 0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1∶3的比例傳代，同樣條件下繼續(xù)擴大培養(yǎng)。

1.3.2實驗分組及干預 收集對數(shù)生長期的人腎小球系膜細胞，按3.0×105個/孔接種于6孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞貼壁后，棄去上清液，將細胞分為4組?？瞻讓φ战M加入MEM正常培養(yǎng)基，高糖組加入含30 mmol/L葡萄糖的MEM培養(yǎng)基，VD3干預組加入含10-8mol/L 1,25-(OH)2D3的MEM培養(yǎng)基，聯(lián)合干預組加入含10-8mol/L 1,25-(OH)2D3和30 mmol/L葡萄糖的MEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4觀察指標及方法

1.4.1細胞形態(tài)觀察 各組培養(yǎng)48 h后收集細胞，在光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.4.2細胞凋亡檢測 細胞形態(tài)觀察后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，終止消化后收集細胞，800×g離心5 min，去上清，加PBS重懸，用PBS將細胞潤洗2次，800×g離心5 min，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率。

1.4.3Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測：收集干預處理48 h后的人腎小球系膜細胞，每孔加入1 mL 4 ℃預冷的PBS洗滌，共3次，按1 mL RIPA裂解液加10 μL PMSF(100 mmol/L)于冰上裂解細胞30 min，4 ℃下13 300×g離心5 min取上清。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，用DG-3022A酶標儀測定OD 568，根據(jù)標準蛋白濃度和相應的OD值計算直線回歸方程，根據(jù)蛋白樣品OD值，利用回歸方程計算出樣品蛋白濃度。灌制12%的分離膠，5%濃縮膠的凝膠，吸取40 μg蛋白樣品和MAKER加入上揚空，120 V恒壓電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，將兔多抗GAPDH、Bcl-2及Bax按比例稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌，加HRP標記二抗1∶50 000稀釋，室溫孵育2 h，TBST充分洗滌，ECL顯色，膠片曝光，掃描成像。用BandScan分析膠片灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組人腎小球系膜細胞形態(tài)學表現(xiàn) 顯微鏡下觀察：空白對照組人腎小球系膜細胞呈梭形，形態(tài)多不規(guī)則，胞質(zhì)清亮，折光性好，細胞核圓形、色較深，可見分裂的細胞核；與空白對照組相比，高糖組、VD3干預組、聯(lián)合干預組的細胞數(shù)目依次減少，細胞體積縮小、胞核皺縮，部分細胞漂浮，胞質(zhì)中有空泡形成，可見凋亡小體。見圖1。

圖1 顯微鏡下各組人腎小球系膜細胞形態(tài)(×100)

2.2各組人腎小球系膜細胞凋亡情況 空白對照組、高糖組、VD3干預組和聯(lián)合干預組的細胞凋亡率分別為(2.150±0.135)%、(7.833±0.326)%、(12.900±0.301)%、(16.967±0.630)%，高糖組、VD3干預組和聯(lián)合干預組均明顯高于空白對照組(P均<0.05)，VD3干預組和聯(lián)合干預組均明顯高于高糖組(P均<0.05)，聯(lián)合干預組均明顯高于VD3干預組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 各組人腎小球系膜細胞凋亡情況

2.3各組人腎小球系膜細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達情況 高糖組、VD3干預組和聯(lián)合干預組Bcl-2蛋白表達量及Bcl-2/Bax均明顯低于空白對照組(P均<0.05)，VD3干預組和聯(lián)合干預組均明顯低于高糖組(P均<0.05)，聯(lián)合干預組明顯低于VD3干預組(P均<0.05)；高糖組、VD3干預組和聯(lián)合干預組Bax蛋白表達量均明顯高于空白對照組(P均<0.05)，VD3干預組和聯(lián)合干預組均明顯高于高糖組(P均<0.05)，聯(lián)合干預組明顯高于VD3干預組(P<0.05)。見圖3及表1。

圖3 各組人腎小球系膜細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達情況

表1 各組人腎小球系膜細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達量及Bcl-2/Bax比較

3 討 論

系膜細胞作為腎臟的主要固有細胞，其異常增殖及其細胞外基質(zhì)的沉積是系膜增生性腎小球腎炎的主要病理特征[6-7]，也是導致腎小球硬化，使各種腎小球腎炎向終末期腎病發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。因此，抑制系膜細胞增殖，促進其凋亡，是控制和治療系膜增生性腎小球腎炎的重要靶點[8]。

相關研究顯示，活性維生素D3可通過調(diào)控凋亡相關基因的表達而抑制人腎小球系膜細胞的增殖，加速細胞凋亡[9-10]。目前有關細胞凋亡的分子機制研究多數(shù)認為，細胞凋亡主要依靠受體途徑、線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑實現(xiàn)[11]。Bcl-2蛋白家族和胱蛋白酶(Caspase)家族在眾多凋亡調(diào)控基因中最受關注，因為線粒體途徑主要由Bcl-2蛋白家族調(diào)控。Bcl-2家族蛋白分兩類，一類為抗凋亡基因，Bcl-2蛋白在抑制細胞凋亡中起重要作用，其可能機制為促進谷胱甘肽進入細胞核，導致核內(nèi)氧化還原失衡，降低Caspases蛋白酶的活性，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生[12]；另一類為促凋亡基因，如Bax蛋白，其可通過增強Caspases蛋白酶的活性，對抗Bcl-2蛋白的抗凋亡作用而誘導凋亡的發(fā)生；另外Bcl-2蛋白可與Bax蛋白相結(jié)合，減弱Bax蛋白的促凋亡作用而進一步抑制凋亡，Bcl-2與Bax的比例是調(diào)控凋亡的關鍵因素[13-14]。

在線粒體上，Bcl-2家族成員可通過調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性來調(diào)節(jié)細胞凋亡；除此之外，Bcl-2家族成員還可在多種生理和病理環(huán)境的刺激下通過改變在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分布，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)的發(fā)生，從而激活Caspase家族、Bcl-2家族等凋亡相關信號分子，誘導細胞凋亡。既往研究顯示，通過提高培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度可誘導系膜細胞凋亡，其機制可能與啟動ERS有關[15-16]。

本實驗發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞凋亡率明顯高于空白對照組，與高紅紅等[17]的研究結(jié)果一致；并發(fā)現(xiàn)高糖干預后，系膜細胞中Bcl-2蛋白表達量減少，Bax蛋白表達量增加，二者比例下調(diào)。其機制可能為高糖刺激可加速損傷血管內(nèi)皮細胞，損傷DNA，誘導ERS的發(fā)生，跨膜蛋白被激活，進一步激活Bcl-2家族的凋亡相關信號分子，打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，誘導細胞凋亡。實驗結(jié)果還顯示，VD3組系膜細胞凋亡率及Bax蛋白表達量明顯高于高糖組，Bcl-2蛋白表達量及Bcl-2/Bax明顯低于高糖組，與本課題組的前期研究結(jié)果相符[18-19]?？紤]1,25(OH)2D3的促凋亡作用可能通過Akt磷酸化Bcl-2家族中的促凋亡因子實現(xiàn)，Bcl-2、Bax基因可通過線粒體途徑介導Cyt-C等物質(zhì)釋放，進一步提高Capase-9、Capase-3蛋白的表達，促進細胞凋亡的發(fā)生。將活性維生素D3作用于高糖誘導下的人腎小球系膜細胞進行聯(lián)合干預，細胞凋亡率高于VD3組，Bcl-2蛋白表達量進一步減少，而Bax蛋白表達量進一步增加，二者比例進一步下調(diào)，作用機制考慮與二者共同作用激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路與線粒體通路引起協(xié)同作用有關。

綜上所述，活性維生素D3干預高糖誘導下的人腎小球系膜細胞可顯著抑制Bcl-2蛋白的表達，增加Bax蛋白的表達，從而誘導細胞凋亡，清除過度表達的系膜細胞及炎性細胞，促進腎組織修復，延緩疾病的進展，為活性維生素D3的臨床應用提供了理論依據(jù)，但其具體機制仍需在后期研究中進一步闡述。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。