李 燕，婁瑩瑩，李佃貴，楊 倩，霍永利，賈 寧，宋艷琦，王亞敏

(1. 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；2. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050000；3. 唐山市血液中心，河北 唐山 063000；4. 河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061001)

潰瘍性結(jié)腸炎屬于炎癥性腸病，其臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便及里急后重等，且病程遷延，久治難愈。該病機(jī)制不完全明確，是多因素、多途徑綜合作用的結(jié)果，其發(fā)病率逐年遞增，且與結(jié)腸惡性腫瘤密切相關(guān)。因此如何提高臨床療效、控制發(fā)作、延緩復(fù)發(fā)、提高生活質(zhì)量是目前研究的重點(diǎn)。國醫(yī)大師李佃貴教授認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎主要病機(jī)為“濁毒內(nèi)蘊(yùn)腸腑，損膜傷絡(luò)”，化濁解毒方經(jīng)臨床驗(yàn)證為治療該病的有效方劑。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了化濁解毒方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用，并揭示其潛在機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動物 清結(jié)級雄性健康Wistar大鼠50只，體重(220±20)g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證編號：1808139，常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物 化濁解毒方由白頭翁15 g、藿香12 g、黃連12 g、茵陳15 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮12 g、當(dāng)歸12 g、芍藥20 g、茯苓15 g、白術(shù)6 g、廣木香9 g、秦皮15 g、地榆12 g、兒茶6 g、苦參9 g、仙鶴草15 g組成，單味藥物購于河北省中醫(yī)院，藥物煎制并濃縮至所需濃度，4 ℃保存?；瘽峤舛痉降蛣┝俊⒏邉┝糠謩e相當(dāng)于成人用量(3.33 g/kg)的6.25倍、12.5倍，即20.8 g/kg、41.6 g/kg。美沙拉嗪腸溶片(葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19980148，規(guī)格：250 mg/片)研成細(xì)粉，溶于蒸餾水，配制成0.3 g/kg溶液。

1.3主要試劑及儀器 2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS，美國Simga)；環(huán)氧合酶2(COX-2)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0732R)；前列腺素E2(PGE2)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)；離心機(jī)TDL-5-A(上海安亭)；電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；600型電熱恒溫水箱(天津泰斯特)；酶聯(lián)免疫檢測儀(MK3 FC)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只Wistar大鼠分成正常組、模型組、美沙拉嗪組、化濁解毒方高低劑量組、化濁解毒方低劑量組，每組10只。大鼠禁食24 h后，采用乙醚麻醉，然后倒置大鼠，將直徑2 mm硅膠管采用石蠟油潤滑后，插入倒置大鼠腸道7～8 cm，正常組大鼠灌以生理鹽水約0.8 mL，其余組大鼠按照100 mg/kg即4 mL/kg給予造模劑(等體積比例混合5%TNBS與50%的乙醇，配置成含有TNBS 25 mg/mL的混合液[1])，垂直倒置大鼠約30 s，使其在腸道內(nèi)充分發(fā)揮作用。造模結(jié)束后，恢復(fù)大鼠正常飲食、飲水，保證環(huán)境清潔、通風(fēng)良好、濕溫度適宜。第2天，模型組、美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組各有1只大鼠死亡。隨機(jī)選取模型組和化濁解毒方高劑量組造模大鼠各1只，斷頭處死，以大鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)不同程度的充血水腫，且有糜爛及潰瘍形成為造模成功。造模成功后，化濁解毒方高、低劑量組分別給予化濁解毒方41.6 g/kg、20.8 g/kg灌胃，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪混懸液0.3 g/kg灌胃，正常組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，均每日1次，連續(xù)14 d。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1疾病活動指數(shù)(DAI)評分 在實(shí)驗(yàn)的整個過程中，觀察大鼠精神、毛發(fā)、體重、糞便、飲食情況，并詳細(xì)記錄，參照Murano等[2]制定的標(biāo)準(zhǔn)計算各組大鼠DAI評分，DAI=(體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。

1.5.2血清炎性細(xì)胞因子水平 灌胃結(jié)束后處死大鼠，眼眶后靜脈叢取血，靜置待凝，2 500 r/min離心15 min，取血清-70 ℃冰箱凍存。采用ELISA法測定各組大鼠血清IL-10、IL-6、PGE2水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.3結(jié)腸組織中COX-2蛋白表達(dá)情況 自距肛門1 cm、3 cm處及潰瘍處取3塊組織，固定于10%福爾馬林溶液，常規(guī)石蠟包埋、切片，然后按照免疫組化步驟進(jìn)行操作[3]：石蠟切片脫蠟至水，用3% H2O2室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗后，PBS浸泡5 min×2次，5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min，滴加一抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜，PBS 沖洗，2 min×3次。二抗37 ℃孵育10～30 min，滴加適量辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS 沖洗，5 min×3次。顯色劑顯色3～15 min，沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察，陽性染色結(jié)果為細(xì)胞漿、胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，采用數(shù)碼顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)觀察并照相，應(yīng)用Image pro-Plus 6.0圖像分析軟件測定其平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠DAI評分比較 正常組DAI評分為0分，模型組、美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組、化濁解毒方低劑量組DAI評分分別為(2.48±0.11)分、(0.71±0.04)分、(0.62±0.03)分、(1.51±0.12)分。美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組、化濁解毒方低劑量組DAI評分均明顯低于模型組(P均<0.05)，美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組均明顯低于化濁解毒方低劑量組(P均<0.05)，化濁解毒方高劑量組與美沙拉嗪組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2各組大鼠血清IL-6、IL-10、PGE2水平比較與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-6、PGE2水平均明顯升高(P均<0. 05), IL-10水平明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組、化濁解毒方低劑量組血清IL-6、PGE2水平均明顯降低(P均<0.05)，IL-10水平均明顯升高(P均<0. 05)；美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組血清IL-6、PGE2水平均明顯低于化濁解毒方低劑量組(P均<0.05)，IL-10水平均明顯高于化濁解毒方低劑量組(P均<0.05)；化濁解毒方高劑量組各指標(biāo)水平與美沙拉嗪組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和潰瘍性結(jié)腸炎各組大鼠血清PGE2、IL-6、IL-10水平比較

2.3各組大鼠結(jié)腸組織中COX-2蛋白表達(dá)情況正常組、模型組、美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組、化濁解毒方低劑量組結(jié)腸組織中COX-2蛋白表達(dá)平均光密度值分別為12.71±1.89，28.39±2.13，17.63±1.92，16.16±2.03，20.68±1.86。模型組明顯高于正常組(P<0.05)；美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組、化濁解毒方低劑量組均明顯低于模型組(P均<0.05)，美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組均明顯低于化濁解毒方低劑量組(P均<0.05)，化濁解毒方高劑量組與美沙拉嗪組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是免疫、遺傳、感染、環(huán)境等多種因素綜合作用的結(jié)果[4]，具有病程長、反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈的特點(diǎn)，已成為全球性健康問題。免疫反應(yīng)異常是潰瘍性結(jié)腸炎的重要發(fā)病機(jī)制，細(xì)胞因子的平衡失調(diào)導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的過度釋放，進(jìn)而造成結(jié)腸黏膜的病理性損傷[5-6]。IL-6由Th1細(xì)胞分泌，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和細(xì)胞毒作用，具有促炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6的過度表達(dá)會影響腸上皮細(xì)胞的通透性，引起炎性細(xì)胞浸潤，從而發(fā)生腸道慢性炎癥[6]；且IL- 6的表達(dá)水平與潰瘍性結(jié)腸炎病情嚴(yán)重程度及病變范圍密切相關(guān)[7]。IL-10屬于Th2型細(xì)胞因子，是細(xì)胞免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，具有抗炎作用，其可以阻斷免疫炎性反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的多重環(huán)節(jié)，穩(wěn)定腸道黏膜的內(nèi)環(huán)境，還可以進(jìn)一步調(diào)控IL- 6、IL- 8等的分泌，維持細(xì)胞因子的動態(tài)平衡[5]。

環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸代謝的關(guān)鍵酶，可以催化各種內(nèi)源性前列腺素的合成，其存在3種同工酶，即COX-1、COX-2和COX-3。COX-2是一種誘導(dǎo)型酶，兼具環(huán)氧化酶、過氧化物酶雙重活性。正常生理狀態(tài)下，COX-2通常不表達(dá)或低表達(dá)，但在炎性刺激或細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，COX-2可在炎性組織高表達(dá)，參與機(jī)體炎癥的病理生理過程。研究表明，COX-2在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。PGE2是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其可以增加血管通透性，進(jìn)而引起組織水腫[10]，同時可引起炎細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜發(fā)生炎癥反應(yīng)，使組織破壞及潰瘍形成[11-12]。Tammali等[13]研究表明，抑制COX-2及PGE2的表達(dá)，可對抗或預(yù)防二者誘發(fā)癌變的作用。

中醫(yī)學(xué)將潰瘍性結(jié)腸炎歸屬于“泄瀉”“痢疾”“腸風(fēng)”“便血”等范疇。國醫(yī)大師李佃貴教授繼承創(chuàng)新，提出了潰瘍性結(jié)腸炎濁毒致病論。濁毒內(nèi)蘊(yùn)，氣機(jī)不暢，不通則痛，因而出現(xiàn)腹痛；濕濁下注腸腑，大腸傳導(dǎo)功能失司，可出現(xiàn)腹瀉；濁毒與氣血膠結(jié)，損膜傷絡(luò)，從而出現(xiàn)黏液膿血。本病纏綿難愈，反復(fù)發(fā)作，正與濁毒的致病特點(diǎn)相契合?；诜阶C結(jié)合，在當(dāng)歸芍藥散、白頭翁湯、香連丸等基礎(chǔ)上自擬具有化濁解毒、理氣和血功效的化濁解毒方，經(jīng)前期臨床觀察證實(shí)該方對潰瘍性結(jié)腸炎具有較好治療作用[14]。本動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化濁解毒方可顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的一般狀態(tài)，降低DAI評分及血清IL-6、PGE2水平，升高IL-10水平，同時能夠抑制結(jié)腸組織中COX-2的表達(dá)，且化濁解毒方高劑量效果更佳。提示化濁解毒方可能是通過下調(diào)IL-6、COX-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制PGE2分泌，同時促進(jìn)IL-10表達(dá)，進(jìn)而恢復(fù)細(xì)胞因子的平衡，抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織的炎癥損傷，促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)，改善潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀，延緩疾病進(jìn)程。但化濁解毒方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制復(fù)雜，有待深層次挖掘，開拓治療潰瘍性結(jié)腸炎的新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。