金頌峰，宮麗鴻，邸靜鑫

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧沈陽 110034；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽 110032；3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)院，遼寧沈陽 110016）

近年來，約40%的患者由于急性冠脈綜合征入院，但其冠脈造影結(jié)果未見明顯異常，這就與先前心外膜冠狀動脈無狹窄便認(rèn)為不存在缺血的觀點(diǎn)不相吻合，說明此時可能存在著冠脈微循環(huán)障礙（coronary microvascular dysfunction，CMD）［1］。冠脈微循環(huán)（coronary microvascular）由微動脈（＜300 μm）、毛細(xì)血管（平均8 μm）和微靜脈（＜500 μm）構(gòu)成，是心肌組織發(fā)生營養(yǎng)交換、維持心臟各生理功能的重要場所［2］。在各種致病因素的作用下，冠脈微循環(huán)的固有結(jié)構(gòu)、功能以及冠脈微血管的阻力出現(xiàn)異常，引發(fā)心肌細(xì)胞灌注不足，導(dǎo)致以心肌缺血為主要癥狀的冠脈微循環(huán)障礙的發(fā)生［3］。CMD 涉及患者人群廣泛，其發(fā)病可增加心血管相關(guān)不良事件的發(fā)生風(fēng)險，引起急性心血管事件甚至死亡的發(fā)生。

隨著中醫(yī)藥治療CMD 的研究日益深入，迫切需要從多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的角度來解釋中醫(yī)藥是如何發(fā)揮的治療作用?！瓣惼?半夏”作為治療心系疾病中藥復(fù)方的核心組成與經(jīng)典藥對，二者常相須為用，可有效改善CMD 的癥狀，在臨床應(yīng)用非常廣泛［4］。正如《太平惠民和劑局方》中的二陳湯，可以充分體現(xiàn)二藥合用之功效。陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium）為蕓香科植物橘（Citrus reticulata）及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效［5］。研究顯示［6］，陳皮的主要有效成分為黃酮類化合物，其具有調(diào)血脂、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、心腦保護(hù)等作用，患者對該化合物的攝入可有效改善心血管疾病。半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit.）為天南星科植物半夏的干燥塊莖，具有燥濕化痰、寬胸散結(jié)之功效，可抗炎、抗血栓、抗心律失常和抗氧化等功效［7］。目前，“陳皮-半夏”藥對治療CMD 的藥效機(jī)制尚不明了，故有待進(jìn)一步探析。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門整合了生物信息學(xué)、計算機(jī)技術(shù)、藥理學(xué)等眾多學(xué)科的新興學(xué)科，能夠從系統(tǒng)層面揭示各類藥物對機(jī)體的調(diào)控作用，在推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［8］。因此，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探析“陳皮-半夏”藥對治療冠脈微循環(huán)障礙的主要活性成分、主要靶點(diǎn)基因、關(guān)鍵通路及其作用機(jī)制，為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗研究提供依據(jù)與思路。

1 資料與方法

1.1 收集篩選藥對活性成分

以“陳皮”、“半夏”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺［9］（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索兩味中藥的所有化學(xué)成分。為更好地篩選藥對中的有效化合物，本研究聯(lián)合口服利用度（Oral bioavailability，OB 值）、類藥性（Drug-like，DL值）對“陳皮-半夏”藥對活性成分進(jìn)行ADME 屬性篩選，基于以往研究［10］將OB≥30%、DL≥0.18 作為為篩選藥對主要活性成分的標(biāo)準(zhǔn)。其中OB 值代表生物口服利用度，能夠反映藥物被機(jī)體吸收進(jìn)入循環(huán)的百分比；DL 值代表類藥性，能夠反映化合物中特定的功能基團(tuán)與大多數(shù)藥物相同或相似的物理特征。

1.2 收集篩選藥對作用靶點(diǎn)

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中收集并篩選出藥對的活性分子及相對應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)后，利用最新版的UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），查詢靶點(diǎn)蛋白對應(yīng)的人類基因名稱，進(jìn)行名稱標(biāo)準(zhǔn)化處理后錄入Excel 表格。使用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建“藥對活性成分-有效靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 收集篩選疾病靶點(diǎn)基因

以“Coronary microvascular dysfunction”、“CMD”為關(guān)鍵詞分別在使用人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，http：//www.genecards.org/）和在線人類孟德爾遺傳基因數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/）進(jìn)行搜索，查找與冠脈微循環(huán)障礙相關(guān)的疾病靶基因，合并2 個數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果，去除重復(fù)和假陽性的基因，獲得疾病靶點(diǎn)基因。計算其Relevance score 中位數(shù)為3.44，以Relevance score＞3.44 作為疾病靶點(diǎn)篩選的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 獲取藥對與疾病的共同靶點(diǎn)

將1.2 得到的“陳皮-半夏”藥對靶點(diǎn)基因與1.3得到的冠脈微循環(huán)障礙靶點(diǎn)基因輸入在線韋恩圖平臺（http//bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index.html）獲得“陳皮-半夏”藥對與CMD 的交集靶點(diǎn)基因，繪制韋恩圖。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將1.4 得到的交集靶點(diǎn)基因上傳至String 平臺［11］（https：//string-db.org/），物種設(shè)置為人類“Homo sapiens”，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，下載其數(shù)據(jù)與初步的PPI 蛋白互作關(guān)系圖。為進(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)基因，將下載的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件中，設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小、顏色來反映連接度值（Degree），再次構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)Degree 值篩選核心靶點(diǎn)基因。

1.6 GO 功能、KEGG 通路富集分析

將1.4 得到的交集靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫中（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），校訂物種信息為人類，設(shè)置P＜0.01 后，對其進(jìn)行GO（gene ontology）生物學(xué)過程富集分析［包括：細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）］和KEGG 代謝通路（KEGG pathway analysis）富集分析，按P 值升序排列，各選擇前20 條分析結(jié)果，使用在線繪圖工具Bioinformatics 平臺（http//http：//www.bioinformatics.com.cn/）分別繪制對應(yīng)的高級氣泡圖。

1.7 構(gòu)建“藥對活性成分-疾病靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape3.7.1 中導(dǎo)入“陳皮-半夏”藥對活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、前20 條KEGG 富集通路，繪制“藥對活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及靶點(diǎn)篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中初步收集到179 個“陳皮-半夏”藥對活性成分，其中陳皮63 個、半夏116個。本研究以O(shè)B 值≥30%、DL 值≥0.18 為為篩選藥對主要活性成分的標(biāo)準(zhǔn)，篩選后得到陳皮活性成分5 種，半夏11 種，共計納入“陳皮-半夏”藥對活性成分16 種，成分信息見表1。

表1 “陳皮-半夏”藥對活性成分Tab 1 Active components of Chenpi-Banxia drug pair

將預(yù)測得到的靶點(diǎn)基因去重后，獲得陳皮活性成分作用靶點(diǎn)69 個，半夏128 個，合并去重處理后，共計得到“陳皮-半夏”藥對活性成分潛在作用靶點(diǎn)105 個，“藥對活性成分-有效靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見圖1。

圖1 “藥對活性成分-有效靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of active components-effective targets

2.2 CMD 疾病靶點(diǎn)及藥對與疾病交集靶點(diǎn)的獲取

合并Genecards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果，去重后共收集到CMD 疾病靶點(diǎn)1 483 個，考慮靶點(diǎn)基因過多，按Relevance Score 分?jǐn)?shù)由高到低進(jìn)行排序，篩選大于其中位數(shù)的靶點(diǎn)后，獲742 個靶點(diǎn)。在Venny 平臺中將篩選出的“陳皮-半夏”藥對活性成分靶點(diǎn)與CMD 疾病靶點(diǎn)取交集，得到56 個交集靶點(diǎn)基因，見圖2。

圖2 “陳皮-半夏”-CMD 交集基因韋恩圖Fig 2 Venny map of intersection target genes of Chenpi-Banxia-CMD

2.3 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

在String 平臺上傳56 個交集靶點(diǎn)基因，下載其數(shù)據(jù)與初步的PPI 蛋白互作關(guān)系圖，見圖3。為篩選核心靶點(diǎn)基因，將下載的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1，繪制高級PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)由56 個節(jié)點(diǎn)和556 條邊構(gòu)成，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，連線越密集，則地位越重要。節(jié)點(diǎn)度值前5 的靶點(diǎn)為AKT1、VEGFA、BCL2、BAX、JUN，分別對應(yīng)45、41、38、37、37，提示這些靶點(diǎn)可能是“陳皮-半夏”藥對治療CMD 的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。

圖3 “陳皮-半夏”藥對與CMD 的初步PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Preliminary PPI network diagram of Chenpi-Banxia drug pair and CMD

圖4 ”陳皮-半夏”藥對與CMD 的高級PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Advanced PPI network diagram of Chenpi-Banxia drug pair and CMD

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對“陳皮-半夏”藥對活性成分治療CMD 的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，共有409 個GO 術(shù)語條目，其中細(xì)胞組成（CC）41 個，分子功能（MF）67 個，生物過程（BP）301 個，KEGG 富集顯示106 條通路。按P 值排序后，取前20 條通過Bioinformatics 網(wǎng)站繪制高級氣泡圖，見圖5～8。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，細(xì)胞組成（CC）主要集中于胞漿（cytosol）、質(zhì)膜（plasma membrane）、核（nucleus）等部位，見圖5；分子功能（MF）主要集中于蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、蛋白質(zhì)同源二聚活性（protein homodimerization activity）、相同蛋白結(jié)合（identical protein binding）等方面，見圖6；生物過程（BP）主要集中于轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA 模板化（positive regulation of transcription，DNA-templated）、凋亡過程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）等方面，見圖7。

圖5 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO-CC 分析Fig 5 GO-CC bubble diagram of Chenpi-Banxia drug pair in the treatment of CMD key targets

圖6 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO-MF 分析Fig 6 GO-MF bubble diagram of Chenpi-Banxia drug pair in the treatment of CMD key targets

圖7 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO-BP 分析Fig 7 GO-BP bubble diagram of Chenpi-Banxia drug pair in the treatment of CMD key targets

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、癌癥通路（Pathways in cancer）、鞘脂信號通路（Sphingolipid signaling pathway）、低氧細(xì)胞應(yīng)激信號通路（HIF-1 signaling pathway）等20 條關(guān)鍵通路與“陳皮-半夏”藥對治療CMD 可能相關(guān)，見圖8。根據(jù)以上KEGG 通路富集結(jié)果，并結(jié)合文獻(xiàn)查閱，篩選出與CMD 相關(guān)的通路，涉及PI3K-Akt、TNF、VEGF、Apoptosis、HIF-1等信號通路。

圖8 “陳皮-半夏”藥對治療CMD 關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析Fig 8 KEGG bubble diagram of Chenpi-Banxia drug pair in the treatment of CMD key targets

2.5 “藥對活性成分-疾病靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將“陳皮-半夏”藥對活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)基因、前20 條KEGG 富集通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.1，繪制“藥對活性成分-疾病靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖9。其中粉色V 形節(jié)點(diǎn)代表通路，紅色與綠色圓形節(jié)點(diǎn)分別代表兩種藥物活性成分，紫色菱形節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，對應(yīng)標(biāo)記見表1。該網(wǎng)絡(luò)圖反映出“陳皮-半夏”藥對治療CMD“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”的調(diào)控特點(diǎn)。

圖9 “藥對活性成分-疾病靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 9 Active ingredients-disease target-pathway network diagram

3 討論

自20 世紀(jì)中期以來，生理學(xué)家已經(jīng)認(rèn)識到冠脈微循環(huán)對于維持心肌灌注具有重要意義［12］，因此對冠脈微循環(huán)障礙的研究顯得尤為重要。冠脈微循環(huán)障礙（CMD）主要指冠脈微循環(huán)血管的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、功能障礙，從而導(dǎo)致微血流異常及血液流變性紊亂［13］。目前的硏究認(rèn)為，CMD 與介入后無復(fù)流、慢血流、微血栓形成、心肌缺血再灌注損傷等有關(guān)［14］。根據(jù)CMD 的臨床表現(xiàn)，可將其歸屬為中醫(yī)學(xué)的“胸痹”范疇?，F(xiàn)代人嗜食肥甘，導(dǎo)致脾氣虛弱，健運(yùn)失施，水濕內(nèi)阻，聚濕生痰。痰凝可致血瘀，二者膠結(jié)而生內(nèi)熱，進(jìn)而熱盛風(fēng)動，導(dǎo)致脈絡(luò)絀急，這就與CMD 血管栓塞痙攣的發(fā)病機(jī)制相似［15］?！瓣惼?半夏”作為祛濕化痰、寬胸散結(jié)的經(jīng)典藥對，是中醫(yī)治療心系疾病中藥復(fù)方中的核心組成。但目前尚缺乏“陳皮-半夏”藥對治療CMD 的相關(guān)實(shí)驗研究，故在此運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行初步探討。

研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“陳皮-半夏”藥對治療冠脈微循環(huán)障礙的潛在作用機(jī)制，通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫得到“陳皮-半夏”藥對關(guān)鍵化學(xué)成分179 個，參與調(diào)節(jié)冠脈微循環(huán)障礙的關(guān)鍵化學(xué)成分105 個，且度數(shù)在前三位為柚皮素［16］、諾比林［17］、黃芩素［18］、β-谷甾醇［19］，均被報道在CMD 等心血管疾病的治療過程中發(fā)揮良好的作用。通過PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的分析中可知，“陳皮-半夏”藥對作用靶點(diǎn)與CMD靶點(diǎn)之間相互影響，靶點(diǎn)間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，表明其治療作用機(jī)制復(fù)雜多樣。統(tǒng)計其中關(guān)聯(lián)性最高的靶點(diǎn)，位于前幾位的靶點(diǎn)分別為AKT1、VEGFA、BCL2、BAX、JUN。AKT1 是PI3K 下游直接的重要蛋白，是AKT 三個同種型蛋白結(jié)構(gòu)中的一種［20］，AKT 活化后可以調(diào)節(jié)VEGF 介導(dǎo)的血管生長［21］，使內(nèi)皮細(xì)胞遷移來減慢心功能受損速度，還可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡來增加心肌細(xì)胞活性，磷酸化的AKT 具有抗凋亡、促細(xì)胞生存及促蛋白合成等活性［22］。BCL2 和BAX 是BCL2 家族中被公認(rèn)的一對調(diào)控凋亡的關(guān)鍵基因［23］，BAX 可降低BCL2表達(dá)并升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而BCL2 則通過一種抗氧化劑或抑制氧自由基生成，改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+外流，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cGMP 含量，抑制細(xì)胞凋亡［24］。JUN 是組成轉(zhuǎn)錄因子AP-1（激活蛋白-1）的一類蛋白族，包括c-JUN、v-JUN、JUN B 和JUN D。研究表面［25］AP-1 通過對各種生長因子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等多種細(xì)胞過程，其中c-JUN 蛋白對誘導(dǎo)炎性介質(zhì)分泌起重要作用［26］。通過可視化網(wǎng)絡(luò)可見“陳皮-半夏”藥對治療CMD 是通過激活A(yù)KT1 抗凋亡與促細(xì)胞生存以保護(hù)心肌細(xì)胞、調(diào)節(jié)VEGF 介導(dǎo)冠脈微循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、調(diào)控BCL2 和BAX 抑制凋亡保護(hù)冠脈微循環(huán)、調(diào)節(jié)JUN 蛋白調(diào)控炎性介質(zhì)分泌以減慢CMD 形成過程中的炎癥反應(yīng)等多途徑多靶點(diǎn)發(fā)揮用，具有多種潛在作用機(jī)制。

GO 生物學(xué)富集過程提示冠脈微循環(huán)障礙的治療與抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制炎性反應(yīng)等密切相關(guān)，這與PPI 得到的結(jié)果相吻合。通過KEGG 通路富集分析及相關(guān)文獻(xiàn)查閱可知，陳皮-半夏”藥對治療CMD 主要涉及PI3K-Akt、TNF、VEGF、Apoptosis、HIF-1 等信號通路。近年來有研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號通路的下調(diào)可以抑制冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和血管形成，提示冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可能與PI3K-Akt 信號通路障礙相關(guān)［27］。TNF 作為炎癥相關(guān)通路，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的生物學(xué)活性占其總活性的70%～95%，可促使大量白細(xì)胞活化、聚集，并黏附于冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，從而阻塞微血管，同時其也可以活化血小板促進(jìn)冠脈微循環(huán)內(nèi)血栓形成，加重組織炎癥，最終導(dǎo)致CMD 的發(fā)生［28］。冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是CMD 發(fā)生的主要病理生理機(jī)制，VEGF 作為介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的重要信號通路能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、促進(jìn)血管增生、增加血管通透性，故VEGF 通路對冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)起到至關(guān)重要的作用［29］。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡可能是引發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙進(jìn)而導(dǎo)致CMD 發(fā)生的重要原因［30］，因此基于Apoptosis 相關(guān)通路，從抑制細(xì)胞凋亡的角度保護(hù)血管內(nèi)皮功能，已成為保證冠脈微循環(huán)穩(wěn)定、治療CMD 不可替代的基礎(chǔ)［31］。HIF-1 作為低氧細(xì)胞應(yīng)激信號通路，其生物活性主要是由HIF-1α 決定。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 的穩(wěn)定表達(dá)對心血管系統(tǒng)有一定保護(hù)作用，當(dāng)HIF-1α 表達(dá)水平增高時，可使患者血清缺氧和炎癥反應(yīng)程度明顯增加，導(dǎo)致冠脈微循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重［32］。

綜上所述，“陳皮-半夏”藥對主要通過保護(hù)冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制細(xì)胞凋亡、影響炎性反應(yīng)等途徑治療冠脈微循環(huán)障礙。研究通過構(gòu)建“藥對活性成分-疾病靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)對“陳皮-半夏”藥對的關(guān)鍵活性成分以及靶標(biāo)進(jìn)行了預(yù)測，并將研究結(jié)果與已知實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行對比，所得結(jié)果真實(shí)可靠，為后續(xù)的“陳皮-半夏”藥對的臨床應(yīng)用以及CMD 相關(guān)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究提供了數(shù)據(jù)支持。