王 蕊，楊正飛

（寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川 750004）

缺血性卒中（cerebral infarction，CI）是栓子阻塞血管，使入顱血流量減少，引起腦組織供血障礙，繼而出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能受損的一類疾病，嚴(yán)重危害人類健康［1-3］。此外，CI 常會(huì)誘發(fā)其他器官的損害，尤以心臟損害多見，后者表現(xiàn)為心律失常、心肌損害、心電圖改變、心肌酶譜異常甚至急性心肌梗死［4-7］，進(jìn)而加重病情，影響患者預(yù)后。目前，對(duì)CI 后誘發(fā)心功能障礙的機(jī)制研究較少［8］，迄今尚未闡明。因此，本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取MCAO 小鼠與Sham 小鼠左心室的基因芯片數(shù)據(jù)，分析二者存在的差異基因，以期分析缺血性卒中后誘導(dǎo)出現(xiàn)心功能障礙的機(jī)制，并為腦卒中相關(guān)心功能障礙的治療提供依據(jù)；同時(shí)，為其他相關(guān)疾病的研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

以美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO DataSets 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）為檢索對(duì)象，檢索時(shí)間截止于2019 年12 月，以“Cerebral infarction and cardiac dysfunction”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取24、72 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)MCAO 小鼠與Sham 小鼠左心室中基因芯片數(shù)據(jù)GSE102558。

1.2 研究方法

下載基因芯片數(shù)據(jù)GSE102558，并通過(guò)R 語(yǔ)言軟件進(jìn)行編程、分析，設(shè)定篩選條件logFC 絕對(duì)值≥1，校正P＜0.05，獲取這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)MCAO 小鼠與Sham 小鼠左心室中的差異表達(dá)基因；同時(shí)，利用R語(yǔ)言軟件繪制差異基因的火山圖和前20 位差異基因的熱圖。

1.3 GO 和KEGG 富集分析

利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）在線分析工具，對(duì)24 h 和72 h 的MCAO 小鼠與Sham小鼠左心室中的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析[9]。其中，以小鼠為物種篩選條件，設(shè)置Select Identifier 為“Official Gene Symbol”，List Type 為“Gene List”，選擇生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能模塊對(duì)差異基因進(jìn)行GO 功能富集分析；同時(shí)，選擇Pathways 進(jìn)行KEGG 通路富集分析。最后，運(yùn)用Omicshare（http://www.omicshare.com/tools/Home/Index/index.html）在線分析工具對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 原始數(shù)據(jù)篩選

本研究為避免如品種、年齡等因素對(duì)基因表達(dá)的干擾，故根據(jù)小鼠品系、鼠齡、分組以及取樣部位相同的原則對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，最終選擇8 周齡C57BL/6J 小鼠，取樣部位為左心室。經(jīng)篩選，符合要求的數(shù)據(jù)顯示，Sham-24 h 組、MCAO-24 h 組、Sham-72 h 及MCAO-72 h 組均具有6 個(gè)樣本數(shù)據(jù)；具體樣本數(shù)據(jù)信息見表1。

表1 樣本數(shù)據(jù)信息Tab 1 Sample data information

2.2 差異基因篩選

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，將缺血24 h 和72 h 的數(shù)據(jù)按Sham 組和MCAO 組進(jìn)行分組，使用R 語(yǔ)言軟件對(duì)整理的數(shù)據(jù)進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)，選擇相關(guān)系數(shù)＞0.9 的樣本，確保準(zhǔn)確檢測(cè)到缺血性卒中誘導(dǎo)后出現(xiàn)心功能障礙的差異基因；對(duì)Sham 組及MCAO 組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)缺血后24 h 和72 h 的Sham 組和MCAO 組樣本數(shù)據(jù)中差異基因分別有187 個(gè)和51 個(gè)（圖1），圖中紅色圓點(diǎn)代表上調(diào)基因，綠色圓點(diǎn)代表下調(diào)基因，黑色圓點(diǎn)代表未變化的基因；分別列出調(diào)控最顯著的前20 位差異基因及表達(dá)值（圖2），圖中顏色越紅代表基因表達(dá)值變化越大。結(jié)果顯示，缺血24 h 變化最顯著的前10 位差異基因分別 為 ：Nr4a1、Tacc2、Pnpla2、Aplnr、Arrdc2、Map3k6、Itgb6、Cblb、Tuba4a 和Bnip3；缺血72h 變化最顯著的前10 位差異基因分別為：Myh7、Gm12295、Itgb6、C130080G10Rik、Hmgcs2、Cmss1、Lrrc52、Fam107a、Lcn2 和Aplnr。其中，Aplnr、Itgb6兩個(gè)基因在24 h 與72 h 均發(fā)生變化。

圖1 差異基因的火山圖Fig 1 Volcanic map of differential genes

圖2 前20 位差異基因的熱圖Fig 2 Heat map of the first 20 differential genes

2.3 GO 功能富集分析

對(duì)24、72 h 缺血性卒中誘導(dǎo)后出現(xiàn)心功能障礙的差異基因影響的生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能，運(yùn)用DAVID 6.8 在線分析工具對(duì)差異基因進(jìn)行GO 功能富集分析后，得出具體結(jié)果如下：

在缺血后24 h，得到100 個(gè)GO 條目，篩選P＜0.05 作為顯著性富集，得到56 條具有顯著意義的條目：在生物過(guò)程方面，有30 條（53.57%）顯著富集條目，涉及整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附負(fù)調(diào)控、膠原纖維組織、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)等；在細(xì)胞組成方面，有11 條（19.63%）顯著富集條目，主要涉及線粒體膜、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)等；在分子功能方面，有15 條（26.78%）顯著富集條目，主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)序列特異性DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。

在缺血后72 h，得到23 個(gè)GO 條目，篩選P＜0.05 作為顯著性富集，得到14 條具有顯著意義的條目：在生物過(guò)程方面，有9 條（64.28%）顯著富集條目，涉及活性氧的種類代謝過(guò)程、肌肉收縮、細(xì)胞基質(zhì)附著力、自噬細(xì)胞死亡、整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路及程序性細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)等；在細(xì)胞組成方面，有4 條（28.57%）顯著富集條目，主要涉及MHCⅡ類蛋白復(fù)合物、蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜外側(cè)的錨定成分和膜錨定成分；在分子功能方面，有1 條（7.14%）顯著富集條目，主要涉及整合素結(jié)合。結(jié)果見圖3。

圖3 前10 位GO 功能富集Fig 3 Top 10 of GO function enrichment

2.4 KEGG 通路富集分析

運(yùn)用DAVID 6.8 在線分析工具對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得出具體結(jié)果如下。

缺血后24 h，共富集到9 條通路，篩選P＜0.05作為顯著性富集，得到5 條顯著富集通路，主要涉及的信號(hào)通路是癌癥中的小RNA、生理節(jié)律、HTLV-I 感染、PI3K-Akt 信號(hào)通路和化學(xué)致癌性。

缺血后72 h，共富集到4 條通路，篩選P＜0.05作為顯著性富集，得到3 條顯著富集通路，主要涉及的信號(hào)通路是PI3K-Akt 信號(hào)通路、酮體的合成與降解、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用。

運(yùn)用Omicshare 在線分析工具對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖4。

圖4 差異基因的KEGG 通路富集分析Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of differential genes

3 討論

自1937 年，Dozzy 首次對(duì)腦血管病可伴心臟功能障礙進(jìn)行報(bào)道以來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者證實(shí)了腦血管病可導(dǎo)致心肌損害，出現(xiàn)心肌酶升高、心律失常、心肌損傷及急性心肌梗死等臨床表現(xiàn)，即出現(xiàn)腦心綜合征［5］。目前，隨著腦梗死患者越來(lái)越多，腦心綜合征的發(fā)病率已占所有急性腦梗死患者的78.3%［10］，并成為腦卒中患者急性期猝死的主要原因［11］，但由于其機(jī)制尚不清楚，臨床上只能對(duì)癥處理，故療效差，治療上較被動(dòng)［12］。因此，對(duì)缺血性卒中后誘發(fā)心功能障礙的機(jī)制進(jìn)行研究將成為今后重要的研究課題。

本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO），獲得缺血性卒中后誘發(fā)心功能障礙的差異表達(dá)基因及相關(guān)通路。結(jié)果表明：隨著腦缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，在缺血后24 h和72 h，會(huì)出現(xiàn)不同的差異表達(dá)基因，其中，Aplnr、Itgb6 兩個(gè)基因在24 h 與72 h 均發(fā)生差異表達(dá)。Aplnr 是一個(gè)典型的G 蛋白偶聯(lián)受體，是apelin 的唯一受體，存在于冠狀動(dòng)脈和肺血管的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞以及心肌與多區(qū)域的腦組織中；Aplnr 主要通過(guò)G 蛋白的亞基（Gαi 或Gαq）來(lái)介導(dǎo)信號(hào)，Gαi有助于PI3K/AKT 的活化和ERK 的激活，Gαq 有助于PLCβ/PKC 的激活；在心肌與腦組織缺血、缺氧早期，會(huì)促進(jìn)Aplnr 的表達(dá)，從而通過(guò)激活PI3K/AKT 和ERKs 信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管新生［13］。Itgb6 可調(diào)節(jié)擴(kuò)散、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)降解等細(xì)胞基本功能［14］。對(duì)差異基因做進(jìn)一步的GO 功能富集與KEGG 通路富集發(fā)現(xiàn)，腦缺血的不同時(shí)間段會(huì)引起心臟發(fā)生不同的生物學(xué)功能及信號(hào)通路改變，而PI3K-Akt 信號(hào)通路是兩個(gè)時(shí)間段都會(huì)涉及的共同信號(hào)通路，因此，可以預(yù)測(cè)出PI3K-Akt 信號(hào)通路為缺血性卒中后誘導(dǎo)出現(xiàn)心功能障礙的主要通路。在PI3K-Akt 信號(hào)通路中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）廣泛存在于心肌細(xì)胞，參與生理病理過(guò)程，如細(xì)胞凋亡、壞死，細(xì)胞自噬，細(xì)胞存活與分化等［15］，PI3K 分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類，其中，Ⅰ類在多種通路中發(fā)揮作用。蛋白激酶B（Akt）是一種廣泛存在于人體各組織中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在Akt1、Akt2 和Akt3 三種亞型［16］，其中，Akt1 和Akt3 廣泛表達(dá)于人體細(xì)胞，Akt2 主要在肝臟和骨骼肌等組織中表達(dá)［17，18］，而Akt 被認(rèn)為是PI3K-Akt 信號(hào)通路的關(guān)鍵。研究表明，PI3K-Akt 信號(hào)通路可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)心血管功能［19］，如Sun 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt 信號(hào)通路具有心臟保護(hù)作用，激活PI3K-Akt 信號(hào)通路，可改善心肌損傷，并抑制心臟肥大的發(fā)生；Ogita 等［21］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，激活PI3K-Akt 信號(hào)通路可改善冠狀動(dòng)脈灌注、心臟收縮及心肌代謝功能。因此，PI3K-Akt 信號(hào)通路與心臟功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)，主要通過(guò)影響心肌細(xì)胞存活、增殖、凋亡以及心肌細(xì)胞能量代謝及調(diào)節(jié)，血管再生等方面，實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)發(fā)生腦梗死時(shí)，腦部血流量減少，引起腦水腫，損害島葉皮質(zhì)及皮質(zhì)下聯(lián)合纖維，使血液中兒茶酚胺的含量增加，也可通過(guò)影響神經(jīng)、體液等多方面因素影響心臟功能，從而引起腦心綜合征［22］。同時(shí)，本研究預(yù)測(cè)結(jié)果得出：缺血性卒中后通過(guò)影響PI3K-Akt 信號(hào)通路的心臟調(diào)節(jié)作用，引起心臟功能障礙。

綜上所述，缺血性卒中后誘導(dǎo)出現(xiàn)心功能障礙的機(jī)制主要涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路。當(dāng)心肌持續(xù)缺血時(shí)，該通路對(duì)抑制心肌細(xì)胞凋亡和減緩心功能惡化速度等方面具有積極的作用［23］。因此，研發(fā)調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路的相關(guān)藥物，可能是治療缺血性卒中后誘導(dǎo)出現(xiàn)心功能障礙的重要方向。