東方梓涵 楊登科 郭媛媛 王飄 彭霜 余曉玲 李江

摘要：目的 建立加味凈屑飲合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用TLC對(duì)白鮮皮、苦參和黃芩進(jìn)行鑒別。采用HPLC對(duì)黃柏酮進(jìn)行定量分析。結(jié)果 可鑒別出白鮮皮、苦參和黃芩且陰性無(wú)干擾。黃柏酮在0.32～4.85 μg間，峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系（Y=390.91X-7.78，R2=0.999 8）?；厥章试囼?yàn)中，黃柏酮平均加樣回收率為97.06%，RSD為1.80%，其余方法學(xué)考察均合格。3批樣品檢得黃柏酮平均含量為39.25 μg/mL。結(jié)論 所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于加味凈屑飲合劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：加味凈屑飲;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);白鮮皮;苦參;黃芩;黃柏酮

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：1007-2349（2021）12-0079-03

“加味凈屑飲”方為昆明市中醫(yī)醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方，由水牛角、生地、紫草、白鮮皮、漏蘆、雞血藤、白花蛇舌草、茜草、威靈仙、蒼術(shù)、苦參、火把花根、黃芩構(gòu)成。具有涼血散瘀、祛風(fēng)除濕的功效。對(duì)瘀熱與風(fēng)濕搏結(jié)于血分，引起的血熱證尋常型銀屑病療效確切，臨床有效率為70.0%[1]。同時(shí)，課題組前期研究表明，本方對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型有較好的治療作用，其機(jī)制可能與抑制IL-17的產(chǎn)生有關(guān)[2]。為促進(jìn)“加味凈屑飲”方的臨床推廣，服務(wù)更多患者，課題組前期對(duì)“加味凈屑飲合劑”的制備工藝進(jìn)行了考察，本文將對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，為申報(bào)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260系列高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司）;Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬科技公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）。

1.2 試藥 黃柏酮、苦參堿對(duì)照品（批號(hào)分別為：111923-201604、110805-202010），白鮮皮、黃芩對(duì)照藥材（批號(hào)分別為：120978-202006、120955-201810）均購(gòu)至中國(guó)食品藥品檢定研究院;加味凈屑飲合劑（批號(hào)分別為2003171，2003172，2003173）由昆明市中醫(yī)醫(yī)院提供;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 加味凈屑飲合劑的制備 按處方比例稱(chēng)取各藥味，加水煎煮2次，每次1 h，濾過(guò)，濾液合并，濃縮，加入適量防腐劑，即得。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 白鮮皮的TLC鑒別 取白鮮皮對(duì)照藥材1 g，加甲醇20 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加甲醇1 mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。另取加味凈屑飲合劑50 mL，加硅藻土5 g，攪拌，蒸干，研細(xì)，加甲醇20 mL，至上述“超聲30 min”起，同法制備供試品溶液[3]。另取不含白鮮皮的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。以硅膠G板為吸附劑，各溶液點(diǎn)樣量均為5 μL。將點(diǎn)樣后薄層板于甲苯-環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶4∶6）中展開(kāi)，噴以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃下顯色[4]。結(jié)果顯示，可檢出白鮮皮且陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1A。

2.2.2 苦參的TLC鑒別 取苦參堿對(duì)照品適量，加乙醇，制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。另取加味凈屑飲合劑50 mL，加濃氨試液調(diào)pH至9～10，靜置10 min，加二氯甲烷50 mL萃取1次，二氯甲烷層蒸干，加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液[5]。取不含苦參的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。以2%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板為吸附劑，各溶液點(diǎn)樣量均為3 μL。將點(diǎn)樣后薄層板先于甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1）中展開(kāi)，展距8 cm，晾干，在于甲苯-丙酮-乙醇-濃氨試液（20∶20∶3∶1）展開(kāi)，晾干，依次噴以碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液，日光下檢視[6]。結(jié)果顯示，可檢出苦參且陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1B。

2.2.3 黃芩的TLC鑒別 取黃芩對(duì)照藥材1 g，加甲醇50 mL，密塞，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加水25 mL溶解，加鹽酸調(diào)pH至2～3，加乙酸乙酯萃取2次，每次25 mL，乙酸乙酯層蒸干，加甲醇1 mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。另取加味凈屑飲合劑50 mL，濃縮至25 mL，至上述“加鹽酸調(diào)pH至2～3”起，同法制成供試品溶液[7]。取不含黃芩的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。以聚酰胺薄層板為吸附劑，各溶液點(diǎn)樣量均為6 μL。將點(diǎn)樣后薄層板于甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）中展開(kāi)[8]，噴以鹽酸酸性1%三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視。結(jié)果顯示，可檢出黃芩且陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1C。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 溶液的配制 取黃柏酮對(duì)照品（純度98.0%）適量，精密稱(chēng)定為0.00330 g，加甲醇定容至10 mL，得323.40 μg/mL的儲(chǔ)備液，取儲(chǔ)備液5 mL，加甲醇定容至10 mL，得161.70 μg/mL的對(duì)照品溶液。另取加味凈屑飲合劑50 mL，加硅藻土5 g，攪拌，蒸干，加甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)重，超聲30 min，補(bǔ)重，濾過(guò)，取續(xù)濾液40 mL蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL，作為供試品溶液[9]。另取不含白鮮皮的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 取“2.3.1”項(xiàng)下各溶液，以Diamonsil C18色譜柱為固定相，乙腈-甲醇-水（23∶23∶54）為流動(dòng)相，236 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在流速1 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL條件下檢測(cè)[10]。結(jié)果顯示，供試品色譜中黃柏酮色譜峰與相鄰色譜峰的分離度≥4.75，理論塔板數(shù)以黃柏酮計(jì)不低于5000。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3.3 線性關(guān)系與范圍考察 取“2.3.1”項(xiàng)下儲(chǔ)備液，按“2.3.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)，進(jìn)樣體積分別為1、5、10、13、14、15 μL。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，黃柏酮在0.32～4.85 μg間線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=390.91X-7.78（R2=0.999 8）。

2.3.4 儀器精密度考察 取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)6次。結(jié)果顯示，黃柏酮峰面積的RSD值為0.53%表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下條件分別于0、4、8、12 h檢測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液和供試品溶液中黃柏酮峰面積的RSD值分別為0.47%和2.32%，表明上述兩種溶液中黃柏酮穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性考察 于同批次味凈屑飲合劑中取6份樣，按“2.3.1”項(xiàng)下制成供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)。結(jié)果顯示，黃柏酮平均含量為39.19 μg/mL，RSD為1.37%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.7 回收率考察 精密移取已知濃度（黃柏酮質(zhì)量濃度為44.17 μg/mL）的加味凈屑飲合劑25 mL，共6份，每份加入2.4 mL，質(zhì)量濃度為421.18 μg/mL的黃柏酮對(duì)照品溶液，取“2.3.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)。結(jié)果顯示，黃柏酮的平均回收率為97.06%，RSD為1.80%，表明本方法回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.8 樣品測(cè)定 取3個(gè)批次（批號(hào)見(jiàn)表2）樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下條件檢測(cè)。結(jié)果顯示，黃柏酮平均含量為39.25 μg/mL，各批次間黃柏酮含量的RSD為2.66%，故本研究初步擬定加味凈屑飲合劑含白鮮皮以黃柏酮計(jì)應(yīng)不少于27.0 μg/mL（按均值的70%擬定）。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

本研究依據(jù)《云南省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑研究技術(shù)指導(dǎo)原則（中藥、民族藥）（試行）》對(duì)加味凈屑飲合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，包括TLC鑒別和含量測(cè)定。

在薄層鑒別中，本研究對(duì)處方中君藥和臣藥（生地、紫草、百花蛇舌草、火把花根、白鮮皮、苦參、黃芩）的TLC鑒別方法進(jìn)行了考察，找到了白鮮皮、苦參和黃芩的TLC鑒別方法，同時(shí)，對(duì)3味藥進(jìn)行了TLC鑒別的耐用性考察。結(jié)果顯示，在15～35℃、相對(duì)濕度為50%～90%環(huán)境下均可檢出白鮮皮、苦參和黃芩，不同廠家薄層板和點(diǎn)樣量的微小變化對(duì)鑒別無(wú)明顯影響。

在含量測(cè)定中，由于2020年版《中國(guó)藥典》未來(lái)收錄水牛角、百花蛇舌草、火把花根、雞血藤的含量測(cè)定項(xiàng)，本研究未對(duì)上述藥物中活性成分進(jìn)行含量測(cè)定研究。其余藥物中，蒼術(shù)的指標(biāo)處方為揮發(fā)油（蒼術(shù)素）不適合選為合劑的質(zhì)控指標(biāo)，漏蘆的指標(biāo)成分（β-蛻皮甾酮）在飲片中含量過(guò)低（0.04%）也不適合。故課題組對(duì)剩余的生地、紫草、白鮮皮、苦參、黃芩、茜草和威靈仙中的指標(biāo)成分進(jìn)行了含量測(cè)定研究。其中生地所含的梓醇和毛蕊花糖苷因出峰時(shí)間過(guò)早，難以在供試品溶液色譜中分離;紫草中的β，β二甲基丙烯酰阿卡寧、黃芩中的黃芩素、茜草中的大葉茜草素在含量檢測(cè)中峰面積過(guò)低;威靈仙中的齊墩果酸有陰性干擾。故最終僅?？鄥⒅械目鄥A和白鮮皮中的黃柏酮。由于苦參堿需用氨基硅膠柱進(jìn)行檢測(cè)，相較黃柏酮要求較高，本研究最終選擇了白鮮皮中的黃柏酮作為含量測(cè)定指標(biāo)。同時(shí)，后期課題組將對(duì)苦參中苦參堿的含量測(cè)定進(jìn)行考察，以不斷提升和完善加味凈屑飲合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為本品申報(bào)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊登科，郭奕妤，吳軍，等.加味凈屑飲治療血熱證尋常型銀屑病60例療效觀察[J].皮膚病與性病，2019，41（5）：631-633.

[2]楊登科，郭奕妤，秦建平，等.加味凈屑飲對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的治療作用IL-17產(chǎn)生的影響[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2020，29（5）：6-8+26.

[3]夏米西奴爾·艾買(mǎi)提江.解毒除濕丸（濃縮丸）制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學(xué)，2019.

[4]白曉丹，曹金一，文愛(ài)東，等.顯迪噴霧劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂[J].中國(guó)藥師，2020，23（3）：578-581.

[5]康寶玲，李明花，秦文杰，等.銀屑舒凝膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2019，46（6）：1262-1266+1343.

[6]江潔怡，李素梅，胥愛(ài)麗，等.參黃搽劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2019，30（11）：1545-1550.

[7]中國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020.

[8]楊帆平，李國(guó)文，奚燕.咳喘六味合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2019，37（1）：55-58+85.

[9]李江，陳凌云，付鵬，等.復(fù)方臭靈丹合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2021，42（2）：58-63.

[10]朱澤兵，牟臘梅，張華.一測(cè)多評(píng)法聯(lián)合聚類(lèi)分析評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地白鮮皮的質(zhì)量[J].華西藥學(xué)雜志，2021，36（1）：81-84.

（收稿日期：2021-07-08）