李莉，路明坤，連國(guó)，周義博，孫煥，劉吉開

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命健康的重大疾病之一[1]，而目前臨床上用于癌癥治療的藥物卻普遍存在毒副作用高、耐藥性強(qiáng)等缺陷[2]，研發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物是當(dāng)前藥物研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)之一.天然產(chǎn)物作為藥物先導(dǎo)化合物的重要來源在藥物研發(fā)領(lǐng)域扮演著重要角色[3].基于天然產(chǎn)物，特別是已知具有生物活性的天然產(chǎn)物，通過“多樣性導(dǎo)向合成”策略構(gòu)建結(jié)構(gòu)新穎、豐富的“類天然產(chǎn)物”化合物庫(kù)，并對(duì)其進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，是加速藥物先導(dǎo)化合物優(yōu)化與改進(jìn)的策略之一[4-5].生物堿在天然產(chǎn)物中占據(jù)重要地位，此前本課題組就對(duì)生物堿的抗腫瘤活性進(jìn)行過探索[6-7].

吡啶[3,4-b]吲哚生物堿β-卡波林(carboline alkaloids)因其抗瘧疾、抗腫瘤、抗病毒、抗炎等活性而備受關(guān)注[8-10].其中，1-(5′-羥甲基-2′-呋喃)-β-卡波林-3-羧酸(flazin)衍生物可促進(jìn)微管蛋白聚合，具有良好的體外抗腫瘤活性.構(gòu)效關(guān)系研究表明，在flazin母體3位、6位、9位、1′位、5′位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可增強(qiáng)其抗腫瘤活性[11-12](圖1).

圖1 β-卡波林生物堿flazin及其類似物Fig.1 β-carboline flazin and its derivatives

冬凌草甲素為對(duì)映貝殼杉烷類二萜，主要來源于中草藥冬凌草及相關(guān)植物.冬凌草甲素具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理活性，其中尤以抗腫瘤作用而備受關(guān)注[13].研究表明：通過結(jié)構(gòu)修飾可提高其生物活性、改善其水溶性、改變其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程等，因此對(duì)冬凌草甲素的結(jié)構(gòu)修飾受到越來越多的重視，其中C(1)、C(14)、C(6)和C(7)位是主要修飾位點(diǎn)，所獲得衍生物大都表現(xiàn)出優(yōu)良的活性[14](圖2).

圖2 冬凌草甲素及其修飾位點(diǎn)Fig.2 Oridonin and its modification-sites

基于β-卡波林生物堿flazin及冬凌草甲素表現(xiàn)出的抗腫瘤活性及其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本文對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，并利用活性官能團(tuán)拼接原理，將β-卡波林和冬凌草甲素雜合成一個(gè)分子骨架.采用改良MTT法研究雜合衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，初步確定了具有良好細(xì)胞毒性的活性分子，為獲得更為低毒、高效的抗腫瘤先導(dǎo)化合物提供了線索.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

除非特別說明，文中所用到的色氨酸(麥克林)、苯甲醛(麥克林)、冬凌草甲素(寶雞辰光)等試劑，均為商業(yè)可得，無需純化處理可直接使用；參照Purification of Laboratory Chemicals(W.L.F.Armarego, Christina Li Lin Chai, Elsevier Inc. 2009)對(duì)文中所用到的有機(jī)溶劑進(jìn)行純化；薄層硅膠板型號(hào)為GF254(60-F250, 0.2 mm, 青島海洋化工廠)，用UV(波長(zhǎng)254 nm)顯色；快速柱層析使用硅膠規(guī)格為青島海洋硅膠60(200～300 mesh ASTM, 青島海洋化工廠)，通常使用乙酸乙酯/石油醚混合溶劑為洗脫劑.

1H NMR、13C NMR、HRMS(ESI)由中南民族大學(xué)藥學(xué)院分析測(cè)試中心完成，其中1H NMR、13C NMR檢測(cè)以氘代氯仿為溶劑，使用Bruker Advance-600(1H: 600 MHz,13C: 150 MHz)、Bruker Advance-500(1H: 500 MHz，13C: 125 MHz)核磁共振儀測(cè)定.

1.2 β-卡波林生物堿flazin及其衍生物的合成

稱取1 mmol L-色氨酸甲酯1、1 mmol 取代芳香醛2于干燥燒瓶中，加入10 mL干燥DCM，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)6 h后加入催化量三氟乙酸(TFA)，繼續(xù)反應(yīng)48 h，再加入5 mL DMF、1 mL三乙胺，冰浴冷卻至0 ℃后緩慢滴加三氯異氰尿酸(TCCA)(1 mmol，溶于1 mL DMF中).0 ℃下繼續(xù)反應(yīng)2～3 h，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去DCM，向燒瓶中加入碎冰待其自然融化，過濾，濾餅用甲醇重結(jié)晶得β-卡波林-3-羧酸甲酯3.所得產(chǎn)物通過1H NMR進(jìn)行表征，波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]一致(圖3).

圖3 β-卡波林-3-羧酸甲酯的合成Fig.3 Synthesis of β-carboline-3-carboxylic methyl ester

前期研究表明，對(duì)卡波林9位烷基化可提高其抗腫瘤活性[12]；同時(shí)為避免裸露N―H對(duì)后續(xù)酯化反應(yīng)的影響，先對(duì)9位N―H鍵進(jìn)行烷基化后在堿性條件下將3-羧酸甲酯轉(zhuǎn)化為3-羧酸，以便后續(xù)在縮合劑存在下與冬凌草甲素C(14)位發(fā)生酯化反應(yīng)得到雜合產(chǎn)物.所得產(chǎn)物通過1H NMR進(jìn)行表征，波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]一致.

9位甲基化β-卡波林-3-羧酸甲酯4的合成：稱取0.5 mmolβ-卡波林-3-羧酸甲酯3于干燥燒瓶中，加入無水DMF(5 mL)、無水THF(5 mL)，冰浴下分批加入NaH(1.5當(dāng)量, 0.75 mmol)后轉(zhuǎn)入室溫反應(yīng)1 h.再在冰浴下向反應(yīng)體系中滴加MeI(1.5 當(dāng)量, 0.75 mmol)，滴加完畢后轉(zhuǎn)入室溫反應(yīng)3 h. 反應(yīng)完成后冰浴下滴加水淬滅，然后倒入冰水混合物中，用乙酸乙酯(EA)萃取3次，將有機(jī)相合并后用無水Na2SO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除揮發(fā)性溶劑，硅膠柱層析得9位甲基化的β-卡波林-3-羧酸甲酯4.

9位甲基化β-卡波林-3-羧酸5的合成：向0.2 mmol的β-卡波林-3-羧酸甲酯4中加入甲醇(5 mL)溶解，磁力攪拌下加入1 mol·L-1NaOH(1 mL)，加熱回流，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程.待原料消失后將反應(yīng)冷卻至室溫，旋蒸除去揮發(fā)性溶劑，加水稀釋，調(diào)pH值到5～6，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，無水Na2SO4干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到9位甲基化的β-卡波林-3-羧酸5(圖4).

圖4 β-卡波林-3-羧酸的合成Fig.4 Synthesis of β-carboline-3-carboxylic acid

1.3 冬凌草甲素衍生物的合成

冬凌草甲素為多羥基化合物，利用不同位點(diǎn)羥基反應(yīng)活性的不同可對(duì)其進(jìn)行選擇性修飾，本文先對(duì)冬凌草甲素C(1)、C(6)、C(7)位進(jìn)行修飾獲得相應(yīng)冬凌草甲素衍生物后，通過C(14)位羥基與β-卡波林-3-羧酸反應(yīng)生成酯化產(chǎn)物[15].

1.3.1 C(1)位修飾

C(1)位羥基氧化產(chǎn)物的合成：稱取冬凌草甲素6(150 mg, 0.41 mmol)于干燥燒瓶中，加入12 mL DCM溶解后，冰浴下分批加入PCC(133.6 mg, 1.5 當(dāng)量)和等量硅膠，冰浴下反應(yīng)30 min后，用硅藻土過濾，DCM洗滌濾餅，濾液加水稀釋后用DCM萃取3次后合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后以96%產(chǎn)率得C(1)位羥基氧化成酮產(chǎn)物7.

C(1)位羥基乙?；a(chǎn)物的合成：稱取冬凌草甲素6(100 mg, 0.27 mmol)于干燥燒瓶中，加入丙酮(10 mL)溶解，攪拌下加入2,2-二甲氧基丙烷(1 mL)、催化量對(duì)甲苯磺酸.56 ℃下反應(yīng)15 min，冷卻至室溫后加水稀釋，用DCM萃取(20 mL×3次)，合并有機(jī)相分別用飽和NaHCO3、飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得7,14-丙酮叉保護(hù)冬凌草甲素8(圖5).

在燒瓶中加入7,14-丙酮叉保護(hù)冬凌草甲素8(90 mg，0.22 mmol)，DMAP(0.1 當(dāng)量)和三乙胺(0.2 mL)，攪拌下滴加乙酸酐(1 mL)，室溫?cái)嚢?.5 h后加水稀釋，用DCM萃取(10 mL×3次)后合并有機(jī)相分別用飽和NaHCO3、飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得1-乙酰氧基-7,14-丙酮叉保護(hù)冬凌草甲素后加入10 mL 10% HCl/THF(體積比1∶1)，室溫?cái)嚢? h后加水稀釋，用DCM萃取(20 mL×3次)，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得1-乙酰氧基保護(hù)冬凌草甲素9(圖5).

圖5 冬凌草甲素C(1)位修飾Fig.5 Modification of oridonin at C(1) position

1.3.2 C(6)位，C(7)位開環(huán)修飾

冬凌草甲素C(6)、C(7)位連二醇通過NaIO4氧化開環(huán)得延命素型衍生物10，并進(jìn)一步通過PCC氧化得延命素型衍生物11.

稱取冬凌草甲素6(182 mg, 0.5 mmol)溶于10 mL水中，加入NaIO4(1.58 g, 7.4 mmol)，室溫下攪拌24 h后用DCM萃取，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)濃縮得延命素型化合物10.將得到的化合物10溶于DCM中，冰浴下分批加入PCC(1.5 當(dāng)量)和等量硅膠，繼續(xù)反應(yīng)30 min后，用硅藻土過濾，DCM洗滌濾餅，濾液加水稀釋后用DCM萃取3次，將有機(jī)相合并后用飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后得延命素型冬凌草甲素衍生物11(圖6).

圖6 冬凌草甲素C(6)位、C(7)位修飾Fig.6 Modification of oridonin at C(6)、C(7) position

得到的冬凌草甲素衍生物7～11均通過1H NMR進(jìn)行表征，波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致.

1.4 β-卡波林與冬凌草甲素雜合衍生物的合成

稱取等摩爾量β-卡波林3-羧酸與冬凌草甲素衍生物于燒瓶中，用DCM溶解后，加入1.1 當(dāng)量EDCI，10%DMAP(摩爾比)和1.5當(dāng)量三乙胺，室溫?cái)嚢柽^夜后，依次用1 mol·L-1HCl、飽和NaHCO3、飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后干法拌樣通過快速硅膠柱層析(石油醚/乙酸乙酯混合溶劑為流動(dòng)相)分離純化得β-卡波林與冬凌草甲素雜合衍生物.

1.5 雜合衍生物抗腫瘤活性研究

采用改良MTT法研究雜合衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響.選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人早幼粒白血病細(xì)胞株HL60、人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480為細(xì)胞模型.待測(cè)化合物用DMSO溶解，以40 μmol·L-1濃度初篩，選定效果較好的化合物后，以40、8、1.6、0.32、0.064 μmol·L-1濃度復(fù)篩，以LOGIT法計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值.每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)順鉑(DDP)為陽(yáng)性對(duì)照，每種處理均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.

2 結(jié)果與討論

2.1 β-卡波林-3-羧酸與冬凌草甲素雜合衍生物的合成

以9位甲基化β-卡波林-3-羧酸和修飾過的冬凌草甲素為原料，以EDCI為縮合劑、DMAP為催化劑、三乙胺為堿，利用卡波林3位羧基和冬凌草甲素14位羥基之間的酯化，可以較高收率得到雜合衍生物(圖7).

圖7 雜合衍生物的合成Fig.7 Synthesis of hybrid derivatives

譜圖解析：

(4aR, 5S, 6R, 6aR, 9S, 11aS, 11bS, 14R)-5, 6-dihydroxy-4,4-dimethyl-8-methylene-1,7-dioxododecahydro-1H-6,11b-(epoxymethano)-6a,9-methanocyclohepta[a]naphthalen-14-yl9-methyl-1-phenyl-9H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylate(12, white solid, 70%):1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δH8.79(s, 1H), 8.23(d,J=7.8, 1H),7.68～7.65(m, 1H),7.65～7.61(m, 2H), 7.52(t,J=7.3, 2H), 7.50～7.46(m, 2H), 7.39(t,J=7.7, 1H), 6.20(s, 1H), 5.86(s, 1H), 5.56(s, 1H), 5.52(dd,J=9.5, 2.1 Hz, 1H), 4.34(dd,J=10.9, 1.4 Hz, 1H), 4.08(dd,J=10.8, 1.9 Hz, 1H), 3.87(dd,J=9.5, 7.8 Hz, 1H), 3.59(d,J=9.6 Hz, 1H), 3.50(s, 3H), 2.74(m, 1H), 1.21(s, 3H), 1.03(s, 3H). HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd. for C39H39N2O7647.2757, found 647.2747.

(1S,4aR,5S,6R,6aR,9S,11aS,11bS,14R)-1-acetoxy-5,6-dihydroxy-4,4-dimethyl-8-methylene-7-oxododecahydro-1H-6,11b-(epoxymethano)-6a,9-methanocyclohepta[a]naphthalen-14-yl9-methyl-1-phenyl-9H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylate(13, white solid, 76%):1H NMR(500 MHz, Chloroform-d)δH8.83(s, 1H), 8.25(d,J=7.9 Hz, 1H), 7.68～7.63(m, 3H), 7.53(t,J=7.4 Hz, 2H), 7.50～7.45(m, 2H), 7.40(t,J=7.5 Hz, 1H), 6.24(d,J=8.7 Hz, 1H), 6.18(broad, 1H), 6.11(s, 1H), 5.94(s, 1H), 5.45(s, 1H), 4.69(dd,J=11.6, 5.4 Hz, 1H), 4.31(d,J=10.7 Hz, 1H), 4.19(d,J=10.6 Hz, 1H), 3.82(m, 1H), 3.56(d,J=10.1 Hz, 1H), 3.49(s, 3H), 2.69(m, 1H), 2.04(s, 3H), 1.13(s, 3H), 1.12(s, 3H).13C NMR(125 MHz, Chloroform-d)δC206.98, 170.17, 165.44, 149.48, 144.53, 143.53, 138.25, 137.21, 135.73, 130.37, 130.06, 129.23, 129.08, 128.44, 128.14, 127.95, 127.76, 121.93, 121.47, 121.19, 119.98, 116.63, 110.51, 96.46, 73.63, 63.61, 61.71, 60.96, 53.24, 40.79, 39.76, 39.31, 33.75, 33.62, 32.26, 30.51, 25.42, 21.80, 21.44, 17.93. HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd. for C41H43N2O8691.3019, found 691.3008.

(3aR,6aS,8aR,11S,13aS,13bS,14R)-4,4-dimethyl-10-methylene-3,8,9-trioxotetradecahydro-8a,11-methanocyclohepta[c]furo[3,4-e]chromen-14-yl9-methyl-1-phenyl-9H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylate(14, white solid, 68%):1H NMR(500 MHz, Chloroform-d)δH8.73(s, 1H), 8.27(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.64～7.58(m, 3H), 7.49(m, 4H), 7.44(d,J=8.2 Hz, 1H), 7.36(t,J=7.5 Hz, 1H), 6.33(s, 1H), 5.96(s, 1H), 5.65(s, 1H), 4.69(dd,J=11.5, 5.6 Hz, 1H), 4.41(d,J=10.1 Hz, 1H), 3.53～3.48(m, 1H), 3.47(s, 3H), 1.08(s, 3H), 0.87(s, 3H). HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd. for C39H37N2O7645.2601, found 645.2591.

(1S,4aR,5S,6R,6aR,9S,11aS,11bS,14R)-1-acetoxy-5,6-dihydroxy-4,4-dimethyl-8-methylene-7-oxododecahydro-1H-6,11b-(epoxymethano)-6a,9-methanocyclohepta[a]naphthalen-14-yl1-(isoquinolin-1-yl)-9-methyl-9H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylate(15, white solid, 72%):1H NMR(500 MHz, Chloroform-d)δH8.91(s, 1H), 8.49(d,J=8.5 Hz, 1H), 8.29(d,J=8.5 Hz, 1H), 8.26(d,J=7.9 Hz, 1H), 8.12(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.97(d,J=8.1 Hz, 1H), 7.74(t,J=7.8 Hz, 1H), 7.68(t,J=7.7 Hz, 1H), 7.60(t,J=7.5 Hz, 1H), 7.53(d,J=8.2 Hz, 1H), 7.40(t,J=7.5 Hz, 1H), 6.40(s, 1H), 6.38(d,J=2.6 Hz, 1H), 6.09(s, 1H), 5.94(d,J=1.6 Hz, 1H), 5.45(s, 1H), 4.69(dd,J=11.4, 5.5 Hz, 1H),4.32(d,J=10.7 Hz, 1H), 4.23(d,J=10.7 Hz, 1H), 3.86(dd,J=8.9, 5.7 Hz, 1H), 3.71(s, 3H), 3.59(d,J=10.1 Hz, 1H), 2.71～2.65(m, 1H), 2.03(s, 5H), 1.15(s, 3H), 1.13(s, 3H). HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd. for C44H44N3O8742.3128, found 742.3115.

2.2 β-卡波林-3-羧酸與冬凌草甲素雜合衍生物抗腫瘤活性篩選

采用改良MTT法研究雜合衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響,初步篩選結(jié)果表明雜合衍生物12、13對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞毒性,特別是化合物13對(duì)腫瘤細(xì)胞株HL-60、A-549、SMMC-7721、MCF-7、SW480的IC50為1.54、4.27、3.69、3.12、1.46 μmol·L-1,分別是抗癌藥物順鉑的6.5、6.8、3.0、9.6、13.1倍,初步表明β-卡波林生物堿與冬凌草甲素雜合有望獲得抗腫瘤活性分子線索(表1).

表1 雜合衍生物12和13抗腫瘤活性研究Tab.1 Anticancer activity study of hybrid molecule 12 and 13