許倩云，崔昊晶

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

分泌性中耳炎是耳鼻咽喉科較常見的炎性疾病，其主要由功能性通氣功能障礙、機械性阻塞造成，臨床表現(xiàn)為鼓室積液、聽力下降等[1-2]。分泌性中耳炎多見于兒童，是造成兒童聽力下降的最主要因素，且病情復雜，易反復發(fā)作，臨床治愈困難[3]。因此，探究分泌性中耳炎的發(fā)病機制具有重要臨床意義。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1，HMGB1)是一種非組蛋白核蛋白，其可參與DNA重組、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等，并可作為炎癥因子在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[4]。Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)是一種天然的免疫特異性病原識別受體，在維持中耳功能等方面發(fā)揮重要作用[5]。然而，關于血清HMGB1、TLR2對分泌性中耳炎的影響目前尚不完全清楚。鑒于此，本研究擬通過檢測分泌性中耳炎患者血清中HMGB1、TLR2的表達情況，探究其在分泌性中耳炎中的作用，以期為臨床提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年9月至2020年7月我院收治的分泌性中耳炎患者140例作為分泌性中耳炎組，其中男81例，女59例，年齡7～15歲，并根據(jù)病情嚴重程度[6]將其分為急性組(63例)和慢性組(77例)。選取同期在我院體檢中心進行體檢的100名健康人員作為對照組，其中男52例，女48例，年齡6～15歲。分泌性中耳炎組和對照組的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

分泌性中耳炎組納入標準：①符合分泌性中耳炎的相關診斷標準[6]；②無分泌性中耳炎家族史；③臨床資料完整。排除標準：①患有甲狀腺、糖尿病等其他內(nèi)分泌疾??；②有過敏性鼻炎等病史；③患有免疫系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準通過(NO.201805-7)，且符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》，所有患者及家屬自愿參加本研究，并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

離心機(型號：RJ-TDL-60A)購自無錫市瑞江分析儀器有限公司；酶標儀(型號：Phomo)購自鄭州安圖生物工程股份有限公司；人HMGB1酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(批號：20171205)購自上海鈺博生物科技有限公司；人降鈣素原(procalcitonin，PCT)ELISA試劑盒(批號：20180103)購自上海晶風生物科技有限公司；人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(批號：20171028，20180209)均購自上海心語生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：20180322)購自杭州聯(lián)科美訊生物醫(yī)藥技術有限公司；總RNA提取試劑盒(批號：20180419)購自北京艾德萊生物科技有限公司；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：StepOne TM)購自美國應用生物系統(tǒng)公司；血清TLR2 mRNA及內(nèi)參GAPDH引物由蘇州鴻訊生物科技股份有限公司合成；其他化學藥品均購自天津永大化學試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及保存 于清晨采集所有研究對象空腹狀態(tài)下靜脈血5 mL，以3 000 r/min的速度離心10 min，分層后收集上層血清，然后置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.3.2 ELISA法檢測血清HMGB1、PCT、TNF-α、IL-6表達水平 將上述血清樣品解凍，然后稀釋標準樣品，在標準孔、空白孔及待測樣品的包被板中分別加樣，將其完全溶解并充分混合均勻，37 ℃條件下溫育30 min；用PBST洗滌液洗滌后拍干，加入50 μL酶標試劑溫育30 min，然后加入終止液至反應停止，最后使用酶標儀進行測定。

1.3.3 qRT-PCR法檢測血清TLR2 mRNA表達水平 取上述保存的待測血清，使用總RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。再以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進行qRT-PCR檢測。PCR反應條件為：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s；60 ℃，25 s；72 ℃，20 s，共40個循環(huán)。血清TLR2 mRNA及內(nèi)參GAPDH的引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法計算血清TLR2 mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 炎癥因子水平比較

分泌性中耳炎組血清炎癥因子PCT、TNF-α、IL-6表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 炎癥因子表達水平比較

2.2 血清HMGB1、TLR2 mRNA表達水平比較

分泌性中耳炎組血清HMGB1、TLR2 mRNA表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。急性組血清HMGB1、TLR2 mRNA表達水平均高于慢性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 分泌性中耳炎組和對照組血清HMGB1、TLR2 mRNA表達水平

表4 急性組和慢性組血清HMGB1、TLR2 mRNA表達水平

2.3 血清HMGB1與TLR2 mRNA表達水平的相關性

Pearson法分析結(jié)果顯示，分泌性中耳炎患者血清HMGB1與TLR2 mRNA表達水平呈正相關(r=0.503，P<0.001)，見圖1。

圖1 血清HMGB1與TLR2 mRNA表達水平的相關性

2.4 血清HMGB1、TLR2 mRNA表達水平與炎癥因子的相關性

Pearson法分析結(jié)果顯示，分泌性中耳炎患者血清HMGB1、TLR2 mRNA表達水平與炎癥因子PCT、TNF-α、IL-6均呈正相關(P<0.05)，見表5。

表5 血清HMGB1、TLR2 mRNA表達水平與炎癥因子的相關性分析

2.5 影響分泌性中耳炎發(fā)生的危險因素分析

以是否發(fā)生分泌性中耳炎為因變量(0=否，1=是)，以分泌性中耳炎組和對照組有統(tǒng)計學差異的指標(血清PCT、TNF-α、IL-6、HMGB1、TLR2 mRNA表達水平)為自變量。PCT、TNF-α、IL-6、HMGB1、TLR2 mRNA分別以各自的平均值為界進行分組：PCT高表達(≥4.18 ng·mL-1)和低表達(<4.18 ng·mL-1)，TNF-α高表達(≥2.43 ng·mL-1)和低表達(<2.43 ng·mL-1)，IL-6高表達(≥6.57 pg·L-1)和低表達(<6.57 pg·L-1)，HMGB1高表達(≥83.92 μg·L-1)和低表達(<83.92 μg·L-1)，TLR2 mRNA高表達(≥1.35)和低表達(<1.35)，以上各指標賦值均為0=低表達，1=高表達。Logistic回歸分析結(jié)果顯示：血清HMGB1、TLR2 mRNA高表達是分泌性中耳炎發(fā)生的危險因素(P<0.05)，見表6。

3 討論

分泌性中耳炎在中耳炎中較為常見，主要分為急性分泌性中耳炎和慢性分泌性中耳炎，其發(fā)病與感染、免疫反應、咽鼓管功能異常、炎癥反應等密切相關[7-9]。流行病學研究顯示，約25%的學齡兒童患有分泌性中耳炎，且經(jīng)治療后易復發(fā)，嚴重影響患兒的身心健康[10]。因此，對分泌性中耳炎的發(fā)病機制進行研究，尋找與該病相關的標志物具有一定臨床意義。

HMGB1是高遷移率族蛋白家族的成員之一，廣泛分布在細胞質(zhì)及細胞核中，可與DNA結(jié)合，在DNA重組、轉(zhuǎn)錄等過程中發(fā)揮重要作用，也可與細胞膜表面受體結(jié)合，激活NF-κB通路，促進免疫應答的發(fā)生[11-12]。王丹等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在支原體感染盆腔炎患者的血清中呈高表達，其表達水平可為支原體感染盆腔炎患者的病情評估及診斷提供參考依據(jù)。分泌性中耳炎是一種炎癥性疾病，其病情嚴重程度與炎癥因子水平變化有關。更藏達杰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，分泌性中耳炎患者血清中炎癥因子PCT、TNF-α表達水平升高，表明二者異常升高與該病的發(fā)展有關。本研究結(jié)果顯示，分泌性中耳炎組患者血清HMGB1表達水平顯著高于對照組，急性組患者血清HMGB1表達水平顯著高于慢性組，且其表達水平與炎癥因子PCT、TNF-α、IL-6均呈正相關，提示血清HMGB1可能參與分泌性中耳炎的發(fā)生發(fā)展。

TLR2是Toll樣受體家族的重要成員，也是機體內(nèi)的一種天然免疫類蛋白分子，其可識別機體內(nèi)多種微生物的相關分子結(jié)構(gòu)，并在機體免疫應答、炎癥反應等方面發(fā)揮重要作用[15-16]。戚明等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TLR2在結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液中呈高表達，其診斷結(jié)核性胸膜炎的AUC為0.774，且與腫瘤壞死因子、TLR4呈正相關，推測其可作為診斷結(jié)核性胸膜炎的潛在生物學指標。Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，TLR2信號傳導能夠清除細菌，及時減輕肺炎鏈球菌誘發(fā)的中耳炎炎癥反應。本研究結(jié)果顯示，分泌性中耳炎組血清TLR2 mRNA表達水平顯著高于對照組，急性組血清TLR2 mRNA表達水平顯著高于慢性組，且其表達水平與炎癥因子PCT、TNF-α、IL-6均呈正相關，提示血清TLR2 mRNA可能參與分泌性中耳炎的發(fā)生發(fā)展。

潘紅梅等[19]的研究顯示，HMGB1在狼瘡腎炎中呈高表達，且可能通過靶向激活TLR/NF-κB通路發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，分泌性中耳炎患者血清HMGB1與TLR2 mRNA表達水平呈正相關，進一步提示血清HMGB1與TLR2 mRNA可能共同在分泌性中耳炎發(fā)病過程中發(fā)揮作用，但其具體機制仍有待進一步證實。此外，本研究Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清HMGB1、TLR2 mRNA高表達是分泌性中耳炎發(fā)生的危險因素，提示監(jiān)測二者表達水平，對評估分泌性中耳炎的發(fā)生有一定的臨床意義。

綜上所述，HMGB1、TLR2 mRNA在分泌性中耳炎患者血清中的表達水平明顯較高，提示二者與分泌性中耳炎的發(fā)生發(fā)展密切相關，可作為分泌性中耳炎病情評估的潛在生物學指標。但分泌性中耳炎的發(fā)生受多種因素影響，因此仍需尋找更多影響分泌性中耳炎發(fā)生的相關因素，為其臨床預防及治療提供一定的參考。