卓 婧,簡育瑩*,盧端萍,唐 雯

(1.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院,福州 350001;2.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院,福州 350015)

隨著防曬概念不斷普及,防曬化妝品得到人們的廣泛使用。防曬劑是防曬類化妝品中的主要功效成分,可分為物理防曬劑和化學防曬劑,大部分防曬化妝品會同時添加物理防曬劑和化學防曬劑。物理防曬劑主要是氧化鋅、二氧化鈦等,安全性相對較高?；瘜W防曬劑有苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)、3-亞芐基樟腦、二苯酮-3、奧克立林等。防曬產(chǎn)品不是一次用量越多越好,過量使用、長期低劑量使用化學防曬劑存在著不同程度致癌、致畸風險[1-3]。因此,建立準確可靠的化學防曬劑含量測定方法是防曬化妝品質(zhì)量安全監(jiān)管的必備技術(shù)支撐。

目前,常用的化學防曬劑的測定方法有高效液相色譜法(HPLC)[4-8]、氣相色譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]等,其中HPLC為主要測定方法,適用性廣、靈敏度高、重現(xiàn)性好,其提取溶劑和流動相主要采用甲醇(或乙腈)-四氫呋喃-高氯酸溶液。2019年國家藥品監(jiān)督管理局頒布的第40號公告[13]也明確規(guī)定了22種化學防曬劑的檢驗方法,并收載入《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中,該方法的提取溶劑和流動相中使用了一定比例的四氫呋喃和高氯酸。四氫呋喃、高氯酸毒性大,對設備材料具有一定腐蝕性[14],對實驗人員及環(huán)境危害較大。鑒于以上方法的不足,本工作采用低毒的異丙醇代替四氫呋喃,低腐蝕性的磷酸代替高氯酸,建立了一種適用性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好,對人員、儀器、環(huán)境更為友好的HPLC 測定22種化學防曬劑含量的方法,并應用該方法對市場上防曬化妝品中的化學防曬劑進行測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器;Milli-Q 型超純水器;ELmasonic S150型超聲波清洗器,XPR56型百萬分之一分析天平。

混合溶劑Ⅰ:體積比為5∶9的含0.1%(體積分數(shù),下同)磷酸的甲醇-異丙醇的混合液。

混合溶劑Ⅱ:體積比為5∶9∶2 的甲醇-異丙醇-0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)的混合液。

單標準儲備溶液Ⅰ:根據(jù)1～20號化學防曬劑(見表1)色譜響應情況,稱取各標準品適量,用混合溶劑Ⅰ溶解后定容至一組20 mL 棕色容量瓶中[其中苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)用少量10%(質(zhì)量分數(shù))氫氧化鈉溶液溶解后,再用混合溶劑Ⅰ定容;甲酚曲唑三硅氧烷、乙基己基三嗪酮、亞甲基雙-苯并三唑基四甲基丁基酚和雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪的脂溶性較高,直接用四氫呋喃溶解并定容],配制成單標準儲備溶液Ⅰ,其質(zhì)量濃度見表1。

混合標準儲備溶液Ⅰ:移取上述單標準儲備溶液Ⅰ各1 mL 于同一25 mL 棕色容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,配制成混合標準儲備溶液Ⅰ,其質(zhì)量濃度見表1。

單標準儲備溶液Ⅱ:稱取對苯二亞甲基二樟腦磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉適量,用混合溶劑Ⅱ溶解并定容于一組20 mL棕色容量瓶中,配制成單標準儲備溶液Ⅱ,其質(zhì)量濃度見表1。

混合標準儲備溶液Ⅱ:移取上述單標準儲備溶液Ⅱ各2 mL 于同一25 mL 棕色容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,配制成混合標準儲備溶液Ⅱ,其質(zhì)量濃度見表1。

表1 標準品相關(guān)信息以及單標準儲備溶液和混合標準儲備溶液的配制Tab.1 Related information of standards,and preparation of single standard reserve solution and mixed standard reserve solution

甲醇、異丙醇、四氫呋喃為色譜純,其余試劑為分析純;試驗用水為超純水。各標準品相關(guān)信息見表1。20批防曬產(chǎn)品來自監(jiān)督抽檢樣品。

1.2 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);檢測波長311,340 nm;柱溫35℃;進樣量10μL。

第Ⅰ組流動相A 為體積比4∶1的甲醇-異丙醇混合液,B為0.1%磷酸溶液;流量1.2 mL·min－1。梯度洗脫程序:0～7.0 min時,A 由20%升至60%;7.0～12.0min時,A由60%升至80%,保持8.0min;20.0～30.0 min時,A 由80%升至99%,保持4.0 min;34.0～34.1 min,A 由99%跳 轉(zhuǎn) 至100%,保持15.9 min;50.0～50.1 min,A 由100%跳轉(zhuǎn)至20%,保持7.9 min。

第Ⅱ組流動相A 為甲醇,B 為0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0);流量1.0 mL·min－1;梯度洗脫程序:0～9.0 min時,A 由5%升至100%,保持6.0 min;15.0～20.0 min時,A 由100%降至5%,保持3.0 min。

1.3 試驗方法

準確稱取化妝品樣品0.25 g,置于25 mL 納氏比色管中,加入適量的混合溶劑(第Ⅰ組防曬劑使用混合溶劑Ⅰ,第Ⅱ組防曬劑使用混合溶劑Ⅱ,下同),渦旋60 s(若為蠟基質(zhì)化妝品,則先加入1 mL 四氫呋喃,渦旋30 s),再加入混合溶劑至近刻度,超聲30 min,取出,待冷卻后定容。

精密移取上述溶液1 mL 于10 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,混勻,經(jīng)0.45μm 濾膜過濾作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照試驗方法對化學防曬劑的混合標準溶液Ⅰ、Ⅱ進行測定,色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution

2.2 提取溶劑和第二步稀釋溶劑的選擇

2.2.1 第Ⅰ組化學防曬劑

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)方法中防曬劑樣品的提取溶劑為體積比250∶450∶300∶0.25的甲醇-四氫呋喃-水-高氯酸混合液,根據(jù)溶劑極性相似的原理,試驗中使用低毒性、低腐蝕性的異丙醇替代四氫呋喃,考察了體積比為3∶1、9∶5、5∶9的含0.1%磷酸的甲醇-異丙醇混合液和體積比為9∶5∶6、5∶9∶6的含0.1%磷酸的甲醇-異丙醇-水混合液對第Ⅰ組20種化學防曬劑提取效果的影響。結(jié)果顯示,提取溶劑為體積比5∶9 的含0.1%磷酸的甲醇-異丙醇的混合液即混合溶劑Ⅰ時提取效果較穩(wěn)定、回收率較高,測得含量與規(guī)范方法測得的結(jié)果基本一致。

試驗進一步比較了在甲醇-異丙醇的混合液中分別加入體積分數(shù)均為0.1%的磷酸、甲酸、高氯酸等不同種類的酸溶液時對第Ⅰ組20種化學防曬劑提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同種類的酸對第Ⅰ組20種化學防曬劑的提取效果無明顯差異,因此試驗選用低刺激性的磷酸。

蠟基質(zhì)化妝品油水分配系數(shù)較大,脂溶性高,在進行樣品提取時,需先加入1 mL 四氫呋喃渦旋30 s助溶后,再加入混合溶劑渦旋、超聲提取,便于蠟基質(zhì)化妝品中化學防曬劑的充分提取。第二步稀釋溶劑考察時,分別以混合溶劑Ⅰ、甲醇為稀釋溶劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),混合溶劑Ⅰ做第二步稀釋溶劑時,苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)色譜峰峰形受溶劑效應影響出現(xiàn)裂峰,而選擇甲醇作為第二步稀釋溶劑時,苯基苯并咪唑磺酸(恩素利唑)色譜峰峰形得以改善,無裂峰,對同組其余化學防曬劑響應也無影響。綜上考慮,試驗采用混合溶劑Ⅰ、甲醇分別作為第Ⅰ組20種化學防曬劑的提取溶劑和第二步稀釋溶劑。

2.2.2 第Ⅱ組化學防曬劑

參考第Ⅰ組提取溶劑,結(jié)合對苯二亞甲基二樟腦磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉防曬劑極性較大的特點,試驗分別采用體積比為5∶9∶2、5∶9∶4、5∶9∶6、5∶9∶8、5∶9∶10的甲醇-異丙醇-0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)的混合液對樣品進行第Ⅱ組化學防曬劑的加標提取。結(jié)果顯示,加入不同比例的0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)對對苯二亞甲基二樟腦磺酸的提取影響不大,回收率均大于90.0%;隨著0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)比例增加,苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉的回收率有所降 低,分 別 為96.7%,85.9%,85.2%,88.0%,80.9%。因此,試驗選擇體積比為5∶9∶2的甲醇-異丙醇-0.02 mol·L－1乙酸銨溶液(磷酸調(diào)至pH 5.0)的混合液即混合溶劑Ⅱ為提取溶劑。

同第Ⅰ組提取步驟,在蠟基質(zhì)化妝品樣品提取時,需先加入1 mL四氫呋喃渦旋30 s助溶后,再加入混合溶劑Ⅱ渦旋、超聲提取;甲醇作為第二步稀釋溶劑時,對苯二亞甲基二樟腦磺酸、苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉提取效果、色譜響應均較好。綜上考慮,試驗中分別采用混合溶劑Ⅱ、甲醇作為第Ⅱ組化學防曬劑的提取溶劑和第二步稀釋溶劑。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱

試驗考察了Agilent ZORBAX SB-C18、Waters SYMMETRY C18、Shim-pack VP-ODS等3款色譜柱對22種化學防曬劑分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),第Ⅰ組化學防曬劑在Waters SYMMETRY C18與Shim-pack VP-ODS色譜柱上的分離效果不佳,其中樟腦苯扎銨甲基硫酸鹽與二苯酮-4、4-甲基芐亞基樟腦與二乙氨羥苯甲酰基苯甲酸己酯無法實現(xiàn)分離,易同時出峰;使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱時,第Ⅰ組20種化學防曬劑色譜峰的峰形好,出峰時間分布合理,且基線平穩(wěn),不影響成分定性定量,第Ⅱ組化學防曬劑同樣具有良好的分離效果,響應值高。綜合考慮,試驗選擇Agilent ZORBAX SB-C18作為色譜柱。

2.3.2 第Ⅰ組防曬劑的流動相

在HPLC分析測定防曬劑成分時,多使用甲醇(或乙腈)-四氫呋喃-高氯酸-水混合液作為流動相體系,該流動相體系易對設備材料造成腐蝕,影響使用壽命。試驗采用異丙醇、磷酸替代四氫呋喃、高氯酸,考察了以甲醇-異丙醇(體積比3∶1、4∶1、5∶1)與0.1%磷酸溶液的混合液為流動相時對第Ⅰ組20種化學防曬劑分離效果的影響。結(jié)果顯示:甲醇-異丙醇(體積比3∶1)與0.1%磷酸溶液的混合液進行梯度洗脫時,二甲基PABA 乙基己酯與丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、甲酚曲唑三硅氧烷與乙基己基三嗪酮不易分開;甲醇-異丙醇溶液(體積比5∶1)-0.1%磷酸溶液的混合液進行梯度洗脫時,雙-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪出峰時間較晚,峰形不好;甲醇-異丙醇溶液(體積比4∶1)-0.1%磷酸溶液的混合液作為流動相梯度洗脫時,第Ⅰ組20種化學防曬劑在58 min內(nèi)獲得良好分離。

另考察了0.1%磷酸溶液與0.1%(體積分數(shù))甲酸溶液對第Ⅰ組20種化學防曬劑分離效果的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種酸均可實現(xiàn)良好分離效果。試驗最終選擇體積比4∶1的甲醇-異丙醇溶液與0.1%磷酸溶液的混合液作為第Ⅰ組流動相。

2.3.3 分組優(yōu)化

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015 年版)方法中對苯二亞甲基二樟腦磺酸在第Ⅰ組進行分離測定時,在其出峰位置附近基線易出現(xiàn)大幅度波動,影響該成分定量的準確性。試驗將對苯二亞甲基二樟腦磺酸放在第Ⅱ組中與苯基二苯并咪唑四磺酸酯二鈉同時分析,色譜峰附近基線平穩(wěn),利于準確定量。

2.3.4 檢測波長

試驗采用雙波長檢測,在對22種化學防曬劑進行190～400 nm 波段紫外光譜掃描分析時,發(fā)現(xiàn)大部分化學防曬劑在311 nm 附近有最大紫外吸收,而對苯二亞甲基二樟腦磺酸在340 nm 附近有最大紫外吸收,其響應值是311 nm 處的2倍多。為了提高檢測靈敏度,試驗選擇對苯二亞甲基二樟腦磺酸的檢測波長為340 nm,其余21種化學防曬劑的檢測波長為311 nm,見圖1。

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

取混合標準儲備溶液Ⅰ、Ⅱ用甲醇稀釋,配制成混合標準溶液系列,按試驗方法進行測定。以22種化學防曬劑的質(zhì)量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果顯示:22種防曬劑的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與對應的色譜峰面積呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)不小于0.9995,其線性參數(shù)見表2。

以陰性防曬類樣品為基質(zhì),分別加入適量混合標準儲備溶液Ⅰ、Ⅱ,按試驗方法制備供試品溶液,以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),以10倍信噪比計算測定下限(10S/N),結(jié)果見表2。22種化學防曬劑的檢出限和測定下限滿足測定要求。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 重復性試驗

選擇乳霜基和蠟基質(zhì)2種不同基質(zhì)陰性樣品,分別按試驗方法進行加標(見表3,各化學防曬劑低濃度水平的加標量),每個基質(zhì)配制6份,計算測定值的相對標準偏差(RSD)。結(jié)果表明,各防曬劑測定值的RSD 均小于3.5%,說明方法重復性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

制備混合標準溶液Ⅰ和Ⅱ,分別放置0,4,8,12,18,24 h后進樣,記錄各化學防曬劑的峰面積。結(jié)果顯示,該體系中各化學防曬劑峰面積的RSD 為0.89%～2.3%,表明混合標準溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 精密度和回收試驗

選擇乳霜基和蠟基質(zhì)2種不同基質(zhì)陰性樣品,添加低、中、高等3個不同濃度水平的標準溶液,按試驗方法制備供試品溶液并測定,計算回收率及測定值的RSD,結(jié)果見表3。

由表3 可知,2 種基質(zhì)中各組分的回收率為86.9%～113%,測定值的RSD 為0.10%～5.6%,表明該法具有良好的準確度和精密度。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝9)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝9)

表3 (續(xù))

2.8 樣品分析

按試驗方法對20批防曬化妝品進行測定,并將測得的防曬劑含量與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中方法測得的結(jié)果進行比較,結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果比較Tab.4 Comparison of determination results of samples %

表4 (續(xù))%

結(jié)果顯示,20批樣品共檢出14種化學防曬劑,兩種方法測定結(jié)果基本一致。

化學防曬劑的分析檢測方法中提取溶劑和流動相多采用含有一定比例的四氫呋喃和高氯酸體系,毒性大,易揮發(fā),腐蝕性強,對設備和配件要求較高,長期使用易縮短設備使用壽命。本工作建立了一種低毒性、低腐蝕性,對儀器、人員、環(huán)境友好的HPLC測定22種化學防曬劑含量的分析方法,用異丙醇、磷酸代替了四氫呋喃和高氯酸,優(yōu)化樣品提取溶劑和流動相,采用雙波長檢測分析,靈敏度高,重現(xiàn)性好,可操作性強,可為化學防曬劑的檢測分析提供參考。