楊建榮 凌凱南 李碧錦 李 軍 季志強(qiáng) 劉菊珍

(廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530021，電子郵箱：13907869384@139.com)

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率具有明顯地區(qū)差異，而近年來中國(guó)前列腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。研究表明，前列腺癌的發(fā)生可能與遺傳、環(huán)境、性激素等有關(guān)[2]，其中遺傳因素在前列腺癌的發(fā)生中具有重要作用[3]。此外，前列腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)雄激素具有依賴性，而雄激素的活性主要由雄激素受體(androgen receptor，AR)調(diào)控[4]。因此，AR在前列腺癌的發(fā)生中也扮演著重要角色。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因組水平上單個(gè)核苷酸的變異而形成的遺傳標(biāo)記，其可以調(diào)控基因表達(dá),引起蛋白功能變化。目前，AR基因的SNP位點(diǎn)與前列腺癌之間關(guān)系的研究報(bào)道較少。故我們篩選AR相關(guān)SNP位點(diǎn)后，采用高分辨率溶解曲線分析技術(shù)檢測(cè)前列腺癌患者與健康體檢者AR基因rs5918762位點(diǎn)的基因型，并使用第一代測(cè)序Sanger法進(jìn)行驗(yàn)證，為闡明AR基因位點(diǎn)rs5918762多態(tài)性與前列腺癌的關(guān)系提供理論參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月至2019年1月期間就診于廣西江濱醫(yī)院泌尿外科和廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科的85例前列腺癌患者作為前列腺癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：常居廣西5年以上；均經(jīng)過兩名以上病理科高年資病理醫(yī)師閱片證實(shí)為前列腺癌；初治患者，未經(jīng)放療或化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他腫瘤疾病或合并嚴(yán)重心肺等嚴(yán)重疾病者；有嚴(yán)重并發(fā)癥或資料嚴(yán)重缺失者。另從這兩家醫(yī)院體檢中心納入85例同期健康體檢者(男性)作為正常對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：常居廣西5年以上；與前列腺癌組患者無遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他腫瘤疾病或合并嚴(yán)重心肺等嚴(yán)重疾病者；血清前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)>4 μg/L者。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)廣西江濱醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 資料收集 收集兩組研究對(duì)象的年齡、體質(zhì)指數(shù)、居住地、血清PSA水平，以及前列腺癌患者的臨床分期、前列腺組織Gleason分級(jí)(根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行評(píng)估)等資料。

1.3 AR基因SNP位點(diǎn)的選擇策略 使用NCBI 的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)與SNPinfo數(shù)據(jù)庫(kù)(https://manticore.niehs.nih.gov/)篩選AR相關(guān)的SNP位點(diǎn)。篩選條件：(1)HapMap中中國(guó)人群中最小等位基因頻率≥5%；(2)多態(tài)位點(diǎn)位于3′UTR區(qū) ；(3)多態(tài)位點(diǎn)之間連鎖不平衡分析提示r2<0.8；(4)位點(diǎn)尚無前列腺癌相關(guān)研究和全基因組關(guān)聯(lián)性研究報(bào)告該位點(diǎn)；(5)在NCBI收錄文獻(xiàn)中有引用該位點(diǎn)。最終僅rs5918762位點(diǎn)符合要求。

1.4 標(biāo)本收集與DNA提取 抽取研究對(duì)象清晨空腹肘靜脈血3～5 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝后置于-80℃冰箱長(zhǎng)期保存待用。采用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取試劑盒(批號(hào)：OSR-M102)提取全血基因組DNA，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用紫外分光光度計(jì)(日本島津公司，型號(hào)：UV-2450)測(cè)定260 nm波長(zhǎng)的吸光度值，以測(cè)定DNA濃度。

1.5 PCR擴(kuò)增 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索AR基因(NM_001348064.1:c.)轉(zhuǎn)錄本附近序列，然后在NCBI primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)輸入FASTA序列，選擇覆蓋rs5918762位點(diǎn)的引物，得到上游引物(GTGAGGACGGGCTGTAGAAG)和下游引物(GTGAGGACGGGCTGTAGAAG)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度198 bp，引物由廣西吉娃娃生物科技有限公司合成。PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(批號(hào)：DRR036A)，根據(jù)說明書進(jìn)行反應(yīng)體系的配置，反應(yīng)體系包括SYBR Green Ⅰ mix(2×)5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.3 μL、下游引物(10 μmol/L)0.3 μL、cDNA 0.4 μL，滅菌蒸餾水加至10 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min，4℃保存至取出產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，置于-20℃冰箱中保存。

1.6 高分辨熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)AR基因rs5918762位點(diǎn)基因型 將9 μL PCR產(chǎn)物與1 μL飽和熒光染料(美國(guó)Idaho公司，批號(hào)：1000rnx)于暗室中依次加入96孔PCR板并混勻，加入1滴礦物油封液面；PCR反應(yīng)：95℃ 30 s，25℃ 30 s，共1個(gè)循環(huán)，保持4℃；將96孔板4 000 r/min離心30 min后，放入LightScanner 384高分辨率溶解曲線突變檢測(cè)/基因分型分析系統(tǒng)(美國(guó)Idaho公司)中，分析溶解曲線，得出rs5918762位點(diǎn)基因型，并與酶切結(jié)果相互佐證。AR基因rs5918762位點(diǎn)基因型如圖1，其中紅色曲線代表基因型TT，綠色和藍(lán)色曲線分別代表基因型CT和CC。

圖1 AR基因rs5918762各基因型溶解曲線

1.7 一代測(cè)序Sanger法驗(yàn)證 使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司，批號(hào)：28106)純化每個(gè)樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，鏈接到pUC19克隆載體(購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因生物科技有限公司)上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，并常溫培養(yǎng)24 h；經(jīng)過藍(lán)白斑法篩選后挑選8個(gè)陽性克隆菌斑進(jìn)行搖菌培養(yǎng)(溶菌肉湯培養(yǎng)基+50 mg/mL氨芐霉素，37℃烘箱培養(yǎng)15 h)后提取質(zhì)粒DNA，并委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)對(duì)各組基因進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析計(jì)算各基因型人群患前列腺風(fēng)險(xiǎn)的比值比(odds ratio,OR)及95%CI。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究人群的特征 兩組研究對(duì)象的年齡、體質(zhì)指數(shù)、居住地差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。85例前列腺癌患者行血清PSA檢測(cè)，為(49.96±3.99)μg/mL，正常對(duì)照組血清PSA水平為(2.29±0.07)μg/mL。前列腺癌患者臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期分別有4例(4.71%)、41例(48.24%)、21例(24.70%)、19例(22.35%)；Gleason評(píng)分≤7分、>7分各32例(37.65%)、51例(60.00%)，2例患者缺失記錄。

表1 兩組研究對(duì)象基線資料的比較[n(%)]

2.2 兩組研究對(duì)象AR基因rs5918762位點(diǎn)基因型分布頻率的比較 在兩組樣本中均檢測(cè)到位點(diǎn)變化。兩組研究對(duì)象在AR基因rs5918762位點(diǎn)上均以TT基因型為主(見表2)，與一代測(cè)序Sanger法檢測(cè)結(jié)果一致。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)顯示兩組的P值均>0.05，說明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一群體，具有人群代表性，見表2。

兩組研究對(duì)象AR基因rs5918762位點(diǎn)基因型分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.155，P<0.001)，其中前列腺癌組AR基因rs5918762位點(diǎn)TC基因型與CC基因型比例均高于正常對(duì)照組，而TT基因型比例低于對(duì)照組，見表3。與攜帶AR基因rs5918762位點(diǎn)TT基因型者相比，攜帶AR基因rs5918762位點(diǎn)CC基因型者[OR=8.377，95%CI(1.286，9.729)，P=0.023]、TC基因型者[OR=3.630，95%CI(1.663,7.967，P=0.001)]患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)[n(%)]

表3 兩組研究對(duì)象AR基因rs5918762位點(diǎn)基因型分布頻率的比較[n(%)]

2.3 AR基因rs5918762位點(diǎn)不同基因型前列腺癌患者的臨床病理特征的比較 3種基因型的前列腺患者的血清PSA水平、Gleason評(píng)分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與攜帶TT基因型患者相比，攜帶CC基因型患者的臨床分期Ⅲ～Ⅳ期比例更高(均P<0.05)，見表4。

表4 AR基因rs5918762位點(diǎn)不同基因型前列腺癌患者的臨床病理特征的比較[n(%)]

3 討 論

編碼人類AR的基因定位于X染色體的長(zhǎng)臂q11-12，由919個(gè)氨基酸組成，含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，相對(duì)分子量約為111 000[6]。目前有關(guān)AR基因多態(tài)性與前列腺癌的相關(guān)性研究中，AR基因多態(tài)性位點(diǎn)主要包括位于第一外顯子區(qū)的(CAG)n和(GGN)n三核苷酸重復(fù)序列STR位點(diǎn)以及SNP位點(diǎn)[7]。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，基因多態(tài)性可能通過影響AR的表達(dá)水平及轉(zhuǎn)錄活性，從而影響雄激素作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路，以刺激前列腺上皮細(xì)胞的過度增生，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展[8-9]。研究表明， AR基因E211G>A多態(tài)性與轉(zhuǎn)移性前列腺癌和雄激素性脫發(fā)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)[10]。還有學(xué)者通過生信分析33個(gè)前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)后發(fā)現(xiàn)，有1/3的SNP風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域位于AR結(jié)合區(qū)域[11]。還有研究顯示，前列腺癌細(xì)胞的AR轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)，T877A基因突變導(dǎo)致AR轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)是去勢(shì)抵抗性前列腺癌發(fā)生的機(jī)制之一[12-13]。以上研究表明，AR基因多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性可能參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，但還需要分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究分析了AR基因rs5918762位點(diǎn)多態(tài)性與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，前列腺癌組AR基因rs5918762位點(diǎn)TC基因型與CC基因型比例更高，而TT基因型比例更低(P<0.05)；與攜帶AR基因rs5918762位點(diǎn)TT基因型相比，攜帶AR基因rs5918762位點(diǎn)CC基因型、TC基因型的人群患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加(均OR>1，P<0.05)。這提示AR基因rs5918762位點(diǎn)基因多態(tài)性可能與前列腺癌的發(fā)病有關(guān)，其中攜帶CC基因型、TC基因型的人群患病概率增加。此外，與攜帶AR基因rs5918762位點(diǎn)TT基因型相比，攜帶AR基因rs5918762位點(diǎn)CC基因型的前列腺癌患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期比例更高(均P<0.05)，這提示AR基因rs5918762位點(diǎn)基因多態(tài)性可能還與前列腺癌的病情發(fā)展有關(guān)，攜帶AR基因rs5918762位點(diǎn)CC基因型、TC基因型的前列腺癌患者的病情進(jìn)展更快，可能預(yù)后亦相對(duì)更差。

本研究存在一些不足之處：(1)本文的研究對(duì)象僅來源于兩家醫(yī)院，樣本較少，且為回顧性研究，今后需要開展多中心、大樣本的前瞻性研究，以獲得更為確切、普適性更強(qiáng)的結(jié)論；(2)前列腺癌發(fā)病是多因素共同作用的結(jié)果，1個(gè)基因的SNP可能無法完全解釋疾病狀況，只能作為輔助診斷的依據(jù)，在今后的研究中應(yīng)納入多因素綜合分析前列腺癌的發(fā)病影響因素。國(guó)際“千人基因組計(jì)劃”研究結(jié)果顯示，在東亞和南亞人群中，AR基因rs5918762位點(diǎn)的C等位基因頻率分別為0.997和0.908，T等位基因頻率分別為0.003和0.092(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)，由此可見CC基因型在亞洲人群更常見，與本研究結(jié)果相反；此外，本研究結(jié)果顯示，Gleason評(píng)分在AR基因rs5918762位點(diǎn)的TC或CC基因型與TT基因型患者之間不存在差異，這些可能也是上述因素所致。因此，AR基因rs5918762位點(diǎn)在前列腺癌發(fā)生和發(fā)展中的具體意義，還需要多中心大樣本研究一步證實(shí)，而其影響機(jī)制也還需要進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

總之，AR基因rs5918762位點(diǎn)的多態(tài)性可能與前列腺癌易感性和疾病發(fā)展有關(guān)，且攜帶AR基因rs5918762位點(diǎn)的CC或TC基因型者前列腺癌易感性增加，攜帶CC基因型的前列腺癌患者疾病進(jìn)展可能更快。