楊碧，劉翔，張明山，田詢，江銀輝*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

自20世紀(jì)80年代以來，侵襲性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)發(fā)生了一些變化，以往常見的白念珠菌感染表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，而由煙曲霉和黃曲霉菌導(dǎo)致的侵襲性曲霉病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-4]。構(gòu)建曲霉菌感染模型是研究曲霉病的前提條件，目前常見的用于構(gòu)建曲霉感染的動(dòng)物模型有大鼠、小鼠及兔等[5]，這些動(dòng)物模型不僅成本高、還存在倫理問題，故而阿米巴變性蟲、線蟲、果蠅及大蠟螟幼蟲成為了最常見的替代模型[6-7]。大蠟螟(GalleriamellonellaL．)為鱗翅目螟蛾科蠟螟亞科蠟螟屬昆蟲，其幼蟲免疫系統(tǒng)由細(xì)胞免疫和體液免疫構(gòu)成，與哺乳動(dòng)物相似[8]；吞噬細(xì)胞介導(dǎo)幼蟲的細(xì)胞免疫，體液免疫應(yīng)答包括蟲體黑化、調(diào)理素和抗菌肽的產(chǎn)生，其中黑化是由于幼蟲黑色素的形成以及沉積造成的[9]。此外，大蠟螟幼蟲繁殖能力強(qiáng)，生長周期短，容易飼養(yǎng)，無自殘性，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，且無需倫理審查[10-11]。故而，大蠟螟是一個(gè)合適的昆蟲模型[12]。目前，研究人員多用大蠟螟感染模型檢測(cè)抗真菌、抗細(xì)菌類藥物藥效及菌株耐藥性等[13-14]，而對(duì)曲霉菌株間毒力檢測(cè)及比較的報(bào)道較少。因此，本研究利用大蠟螟幼蟲構(gòu)建煙曲霉和黃曲霉感染模型，用于評(píng)價(jià)曲霉致病力，為研究針對(duì)病原體的免疫反應(yīng)和評(píng)估抗真菌藥物的效果等實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株和昆蟲 煙曲霉菌株ygy來源于病人腦脊液，黃曲霉菌株LD-F來源于呼吸科病房空氣；大蠟螟幼蟲120條，體質(zhì)量為200～280 mg/條，老熟幼蟲，通體為淺黃色、無斑點(diǎn)，購自天津惠裕德生物科技有限公司，置于37 ℃黑暗環(huán)境培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑和儀器 LEICA DM500顯微鏡和生化培養(yǎng)箱(天津賽得利斯)，恒字PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，GENESPEED 1730R離心機(jī)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、吐溫-80及Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(北京索萊寶)，微量注射器(上海安亭)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)制備 稱取馬鈴薯200 g、葡萄糖200 g及瓊脂粉13 g，蒸餾水加至體積1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2菌懸液制備 將煙曲霉ygy和黃曲霉LD-F分別接種于PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d，含0.1%吐溫80的PBS 10 mL沖洗PDA培養(yǎng)基表面的菌絲，滅菌的擦鏡紙過濾，收取曲霉孢子；所得濾液8 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS再次重懸，8 000 r/min離心10 min，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整曲霉分生孢子的質(zhì)量濃度為1×108CFU/L(低劑量組)、1×109CFU/L(中劑量組)及1×1010CFU/L(高劑量組)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 60條大蠟螟幼蟲隨機(jī)均分為6組，每條幼蟲參考文獻(xiàn)[15]方法注射煙曲霉ygy和黃曲霉LD-F孢子懸液高、中、低不同劑量各10 μL，每5條幼蟲裝于鋪有濾紙的9 cm干凈培養(yǎng)皿中；60條大蠟螟幼蟲隨機(jī)均分為6組，對(duì)應(yīng)于2種曲霉各設(shè)置3種形式對(duì)照，即空白對(duì)照(untouched larvae,UTC)組(不做任何處理)、穿刺(pierced larvae,PC)組(微量注射器穿刺但不注射PBS)及PBS組(注射接種PBS 10 μL )。

1.2.4建立模型 參考文獻(xiàn)[16]方法建立感染模型，即70%乙醇浸泡棉球清洗感染組和對(duì)照組幼蟲的右側(cè)尾足區(qū)，固定幼蟲，微量注射器1×108CFU/L、1×109CFU/L及1×1010CFU/L 孢子懸液分別取10 μL注入相應(yīng)劑量組的大蠟螟蟲體內(nèi)；大蠟螟幼蟲置于37 ℃培養(yǎng)箱黑暗環(huán)境培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)5 d，每天記錄大蠟螟幼蟲體表顏色變化、應(yīng)對(duì)刺激反饋及存活情況，當(dāng)大蠟螟幼蟲對(duì)外界刺激持續(xù)無反應(yīng)時(shí)認(rèn)為已死亡；黑化的幼蟲死亡，再結(jié)合以下病理組織切片觀察可判斷模型構(gòu)建是否成功。

1.2.5病理組織切片 高劑量組大蠟螟幼蟲感染48 h后，取UTC組和此時(shí)死亡的大蠟螟幼蟲，從幼蟲尾部縱向切開蟲體，約1 cm，浸泡于4%多聚甲醛72 h；將固定的幼蟲包埋于石蠟中，切片，蘇木精和伊紅(haema eosin，HE)染色，對(duì)幼蟲進(jìn)行病理學(xué)檢查；切片進(jìn)行六銨銀染色，觀察大蠟螟幼蟲體內(nèi)菌絲形成情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大蠟螟幼蟲感染狀態(tài)

煙曲霉接種24 h后，各劑量組大蠟螟幼蟲開始出現(xiàn)黑化并死亡，未死亡的幼蟲對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，但每條幼蟲的黑化程度與接種孢子懸液質(zhì)量濃度無明顯相關(guān)；UTC組、PC組和PBS組大蠟螟幼蟲無死亡，通體呈淺黃色、無色斑，行動(dòng)活躍，應(yīng)對(duì)所受外界刺激反應(yīng)靈敏。黃曲霉接種24 h后，高劑量組大蠟螟幼蟲開始出現(xiàn)黑化并死亡，低劑量組與中劑量組幼蟲無死亡，但多數(shù)幼蟲在應(yīng)對(duì)外界刺激時(shí)反應(yīng)微弱；黃曲霉接種48 h后出現(xiàn)大量幼蟲黑化后死亡，其黑化程度無規(guī)律；UTC組、PC組和PBS組大蠟螟幼蟲無死亡，外觀無明顯變化，應(yīng)對(duì)所受外界刺激反應(yīng)靈敏。見圖1。

圖1 各組大蠟螟幼蟲干預(yù)48 h后的一般狀態(tài)Fig.1 The general status of G. mellonella larvae in each group after 48 h intervention

2.2 體腔組織的病理特征

高劑量煙曲霉組和高劑量黃曲霉組大蠟螟幼蟲接種曲霉孢子懸液后，蟲體均發(fā)生黑化、死亡，HE切片可見幼蟲體腔結(jié)構(gòu)遭到破壞，但UTC組幼蟲體腔結(jié)構(gòu)完整；六銨銀染色切片可見煙曲霉高劑量組和黃曲霉高劑量組幼蟲體腔內(nèi)有真菌菌絲團(tuán)，但UTC組幼蟲體腔無真菌菌絲著色。見圖2。

2.3 存活率

煙曲霉接種24 h時(shí)，低、中、高劑量組大蠟螟幼蟲存活率分別為80%(8/10)、90%(9/10)及90%(9/10)；接種48 h和72 h時(shí)，3組大蠟螟幼蟲存活率分別為70%(7/10)、90%(9/10)、20%(2/10)和70%(7/10)、70%(7/10)、0%(0/10)；接種96 h時(shí)，低、中劑量組大蠟螟幼蟲存活率分別為60%(6/10)、30%(3/10)；接種120 h時(shí)，低、中劑量組大蠟螟幼蟲存活率分別為60%(6/10)和10%(1/10)；UTC組、PC組及PBS組大蠟螟幼蟲存活率為100%(10/10)；對(duì)照組與感染組存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。接種孢子質(zhì)量濃度越高存活率越低，低劑量組、中劑量組及高劑量組存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 8)。黃曲霉接種24 h時(shí)，低劑量、中劑量組大蠟螟幼蟲存活率均為100%(10/10)，但高劑量組為80%(8/10)；接種48 h時(shí)，低劑量組大蠟螟幼蟲存活率為80%(8/10)，中劑量、高劑量組的存活率為0%(0/10)；接種72 h時(shí)，低劑量組大蠟螟幼蟲存活率為70%(7/10)；96 h后，低劑量組的存活率為70%(7/10)；接種120 h時(shí)，低劑量組大蠟螟幼蟲存活率為70%(7/10)；UTC組、PC組及PBS組大蠟螟幼蟲存活率為100%(10/10)，對(duì)照組與感染組存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。接種孢子質(zhì)量濃度越高存活率越低，低、中及高劑量組大蠟螟幼蟲存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。見圖3。

注：圖中紅色箭頭所指為真菌菌絲團(tuán)。圖2 各組大蠟螟幼蟲感染48 h后死亡蟲體的組織病理特征Fig.2 Histopathological characteristics of dead worms in each group of G.mellonella larvae 48 h after infection

3 討論

大蠟螟屬于昆蟲，有卵、幼蟲、蛹及成蟲4個(gè)發(fā)育階段，幼蟲的老熟階段常用于構(gòu)建感染模型[17]。與線蟲相比而言，昆蟲的抗菌防御系統(tǒng)相對(duì)高級(jí)，因免疫系統(tǒng)的差異，昆蟲模型與哺乳動(dòng)物模型的研究結(jié)果也存在著一定的差異[18]。但多項(xiàng)研究表明，大蠟螟幼蟲作為一種昆蟲模型，大部分研究結(jié)果與哺乳動(dòng)物模型有正相關(guān)性[19-20]，如Brennan等[21]研究表明，白念珠菌突變體的毒力在大蠟螟幼蟲與Balb/C 小鼠體內(nèi)中的測(cè)定結(jié)果一致。大蠟螟幼蟲最初是作為一種用于研究酵母菌感染的體內(nèi)模型，目前已被廣泛的應(yīng)用于各種微生物的研究[22-24]。大蠟螟被廣泛應(yīng)用的原因在于其能于37 ℃下生長繁殖，符合人類病原體研究的重要的特征。在生物基因組的研究中，大蠟螟有許多與人類基因同源物編碼產(chǎn)物參與病原體的識(shí)別或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[25-27]。

研究認(rèn)為大蠟螟幼蟲的黑化是由于血淋巴中酚氧化酶的激活造成，在昆蟲抵御各種病原體過程中至關(guān)重要，也是幼蟲免疫反應(yīng)的一部分，感染幼蟲的黑化表現(xiàn)為斑駁的灰色到均勻的黑色外觀，其程度具體取決于感染的菌株[28-30]。但目前尚無研究證實(shí)大蠟螟的黑化與所感染真菌的毒力及幼蟲的載菌量有直接相關(guān)性[31]。本研究結(jié)果表明，煙曲霉和黃曲霉感染大蠟螟幼蟲后，幼蟲出現(xiàn)黑化、死亡，2種菌株相同劑量感染導(dǎo)致的黑化的程度無明顯差異，同一菌株但不同接種劑量感染導(dǎo)致的幼蟲黑化程度也無明顯相關(guān)，同一個(gè)處理的感染幼蟲黑化程度情況有少許差異。

此前，大量研究表明，煙曲霉菌是引起曲霉病的第一大病原菌，黃曲霉菌次之[32-33]。本研究結(jié)果提示，大蠟螟幼蟲可以承受較低的曲霉菌感染劑量，接種煙曲霉時(shí)低劑量組大蠟螟幼蟲最終的存活率為60%，接種黃曲霉時(shí)低劑量組大蠟螟幼蟲的最終存活率為70%，說明存活的大蠟螟幼蟲產(chǎn)生了抗曲霉的免疫應(yīng)答，故而可以抵抗低劑量曲霉感染。但在最高劑量下，煙曲霉和黃曲霉都會(huì)導(dǎo)致大蠟螟幼蟲大量死亡，說明幼蟲免疫應(yīng)答失敗中、高劑量組黃曲霉可以較短時(shí)間內(nèi)殺死大蠟螟幼蟲，而煙曲霉所用時(shí)間稍長，但低劑量煙曲霉的存活率比黃曲霉低，此致病機(jī)理有待進(jìn)一步研究。在病理組織切片觀察中，低倍鏡下可見煙曲霉感染大蠟螟幼蟲模型多處菌絲團(tuán)，HE及六銨銀染色切片均表明煙曲霉感染后引起大蠟螟幼蟲體腔結(jié)構(gòu)的破壞程度更嚴(yán)重。根據(jù)此結(jié)果推斷，煙曲霉和黃曲霉菌的毒力存在明顯不同，但2種曲霉菌接種引起的死亡率均有孢子懸液質(zhì)量濃度依賴性，與既往研究結(jié)果一致[34]。因此，本研究對(duì)曲霉毒力評(píng)價(jià)的研究表明了該模型的可靠性和實(shí)用性，提示大蠟螟幼蟲可以作為構(gòu)建曲霉感染的模型。

煙曲霉感染 黃曲霉感染圖3 不同曲霉感染120 h時(shí)各組大蠟螟幼蟲的存活情況Fig.3 Survival curves of the G. mellonella larvae in each group after 120 h intervention

綜上所述，利用大蠟螟幼蟲構(gòu)建曲霉感染模型中，其死亡后黑化程度與曲霉毒力無相關(guān)性，但其存活率可以用于判斷菌株毒力。大蠟螟幼蟲可以快速穩(wěn)定的評(píng)價(jià)曲霉的致病力，研究針對(duì)病原體的免疫反應(yīng)和評(píng)估抗真菌藥物的效果等實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)基礎(chǔ)，為研究曲霉感染提供了一種重要的體內(nèi)模型選擇。