黃甫靜，張金娟，馮敏，廖尚高，何迅

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.葵花藥業(yè)集團(tuán)貴州宏奇有限公司，貴州 六盤水 553400；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

芪斛楂顆粒是由黃芪、山藥、炙甘草、石斛、茯苓、炒麥芽、山楂、木瓜、黨參、陳皮及白術(shù)11味藥味組成的中藥復(fù)方制劑，臨床上用于脾失健運(yùn)引起的易感冒、厭食及便溏等癥的治療，療效確切[1]。研究表明，脾虛與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)又與巨噬細(xì)胞的功能密切相關(guān)[3]，諸多關(guān)于脾虛證的研究將巨噬細(xì)胞作為了研究對(duì)象[2-4]。已有研究表明，組成芪斛楂顆粒制全方的11味藥均具有免疫調(diào)節(jié)方面的活性[4-14]，其中黃芪、甘草、茯苓、黨參及白術(shù)還可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖、增強(qiáng)其吞噬活性，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[15-19]。芪斛楂顆粒組分眾多、成分復(fù)雜，其發(fā)揮作用的活性部位目前尚不清楚，探討其活性部位有利于提高該制劑的質(zhì)量控制水平和進(jìn)一步的應(yīng)用推廣[20]。本研究按照極性差異將芪斛楂顆粒分成4個(gè)不同部位，以小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7為對(duì)象，考察芪斛楂顆粒不同部位對(duì)巨噬細(xì)胞的影響，為評(píng)價(jià)芪斛楂顆粒的免疫調(diào)節(jié)活性及活性部位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞 小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2主要藥品和試劑 芪斛楂顆粒浸膏(葵花集團(tuán)貴州宏奇有限公司)，磷酸鹽(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液(PBS粉末自配，pH 7.2～7.4，質(zhì)量濃度11.74 mg/L；無錫傲銳東源)，伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)和0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco)，胎牛血清(美國(guó)ScienCell)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))，四唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)及中性紅染料(北京索萊寶)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基)。

1.1.3主要儀器 SG8200HE型超聲波提取器(上海冠特)，TB-2150D型梅特勒-托利多十萬分之一天平(北京賽多利斯)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)，Primo Vert型倒置顯微鏡(成貫儀器)，SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備),NoveCyte流式細(xì)胞儀(美國(guó)艾森生物)。

1.2 研究方法

1.2.1芪斛楂顆粒不同部位的制備 取斛楂顆粒浸膏100 g，加水500 mL溶解，加95%乙醇使含醇量為80%，攪拌均勻，靜置12 h，抽濾、收集沉淀物，按savage試劑 ∶粗多糖溶液=1 ∶5加savage試劑，充分?jǐn)嚢? h，8 000 r/min離心 10 min，取上清液，棄濾渣，重復(fù)操作5～6次，取上清液減壓濃縮，冷凍干燥后即得多糖，為A部位(fraction A，F(xiàn)r.A)；在多糖樣品中濾出沉淀物(多糖)后，收集濾液，減壓濃縮得浸膏，冷凍干燥，得非多糖浸膏備用；濕法上大孔樹脂D101柱，以水、75%乙醇和95%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥，分別得水洗脫部位(fraction B，F(xiàn)r.B)、75%乙醇洗脫部位(fraction C，F(xiàn)r.C)及95%乙醇洗脫部位(fraction D，F(xiàn)r.D)。

1.2.2RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞使用含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換液1次，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3芪斛楂顆粒不同部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以1×108個(gè)/L的密度按100 μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h；吸棄原培養(yǎng)基，加7.81、15.73、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00及1 000.00 mg/L芪斛楂顆粒Fr.A、Fr.B、Fr.C及Fr.D，空白組加不含藥物的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；藥物作用24 h ，每孔分別避光加5%MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，吸盡孔中溶液，每孔加DMSO 150 μL搖床振蕩10 min。酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(optical density，OD)，計(jì)算細(xì)胞增殖率[細(xì)胞增殖率(%)=OD處理組/OD空白組×100%]。

1.2.4芪斛楂顆粒Fr.A部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以1×108個(gè)/L密度按100 μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，將RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為空白組(不含藥物的完全培養(yǎng)基)、LPS組(5.00 mg/L)及Fr.A組[低(30.00 mg/L)、中(60.00 mg/L)及高劑量組(120.00 mg/L)]，按分組情況給藥，空白組給予等體積的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)24 h，吸棄上清，每孔加中性紅試劑200 μL，培養(yǎng)2 h，PBS洗滌3遍，加乙酸-乙醇溶液(50%乙醇、1%乙酸及49%水，200 μL/孔)，常溫振搖15 min，于540 nm處測(cè)定OD值，并計(jì)算中性紅吞噬率[中性紅吞噬率(%)=OD處理組/OD空白組×100%]。

1.2.5芪斛楂顆粒Fr.A部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖周期的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，以1×109個(gè)/L的密度按2 mL/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，按“1.2.4”項(xiàng)下分組情況設(shè)置各試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，預(yù)冷PBS洗滌1遍，0.25%胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，收集細(xì)胞；預(yù)冷PBS洗滌3遍，加預(yù)冷70%乙醇500 μL，4 ℃固定過夜，1 000 r/min 離心3 min；預(yù)冷的PBS洗滌3遍，棄上清，加PI/RNase(PI ∶RNase=9 ∶1)工作液500 μL，室內(nèi)避光放置60 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的周期變化，每組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算染色平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖活性

與空白組相比，質(zhì)量濃度15.73～1 000.00 mg/L Fr.A和Fr.C組RAW264.7細(xì)胞的增殖率上升(P<0.05或P<0.01)，質(zhì)量濃度500.00～1 000.00 mg/L Fr.B組RAW264.7細(xì)胞的增殖率明顯增加(P<0.01)，質(zhì)量濃度7.81～1 000.00 mg/L Fr.D組RAW264.7細(xì)胞的增殖率無明顯變化(P>0.05)。見圖1。

注：A～D分別為芪斛楂顆粒Fr.A、Fr.B、Fr.C及Fr.D部位；與空白組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01。圖1 芪斛楂顆粒不同部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Effects of different fractions of qihuzha granule on RAW264.7 cell proliferation

2.2 Fr.A部位對(duì)RAW264.7 細(xì)胞吞噬活性的影響

結(jié)果顯示，與空白組相比，LPS組RAW264.7細(xì)胞的中性紅吞噬率明顯上升(P<0.01)，低、中、高劑量Fr.A組RAW264.7細(xì)胞的中性紅吞噬率隨藥物質(zhì)量濃度的增大而增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

注：與空白組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖2 芪斛楂顆粒Fr.A部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.2 Effects of Fr.A of qihuzha granule on phagocytic activity of RAW264.7 cells

2.3 Fr.A部位對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖周期的影響

結(jié)果顯示，與空白組比較，LPS組和中、高劑量Fr.A組RAW264.7細(xì)胞在G0/G1期的細(xì)胞比例上升、G2/M期的細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，S期的細(xì)胞比例無變化(P>0.05)。見圖3。

注：A～E分別為空白組、LPS組、低劑量Fr.A組、中劑量Fr.A組及高劑量Fr.A組的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，F(xiàn)為各組細(xì)胞周期定量結(jié)果；與空白組比較，(1)P<0.01,(2)P<0.05。圖3 各組RAW264.7細(xì)胞的增殖周期Fig.3 Cell cycles of RAW264.7 cells in each group

3 討論

芪斛楂顆粒對(duì)小兒脾胃氣虛引起的相關(guān)臨床癥狀有良好的治療作用，“脾為之衛(wèi)”，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的維持被認(rèn)為是脾臟的重要功能之一，脾虛時(shí)機(jī)體的免疫功能受到抑制[21]。在細(xì)胞層面表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞的活性減弱、增殖受到抑制、吞噬功能顯著下降，自然殺傷細(xì)胞的活性降低，T細(xì)胞和B細(xì)胞等淋巴細(xì)胞的增殖活性受到抑制等方面的改變[22-23]。有研究認(rèn)為，巨噬細(xì)胞的功能下降是脾虛證免疫功能失調(diào)的重要機(jī)制之一[24]。巨噬細(xì)胞是皮膚黏膜屏障之后抵抗病原微生物入侵的第一道防線，對(duì)天然免疫和獲得性免疫均有重要影響，在免疫系統(tǒng)中占據(jù)了重要地位[25]。研究表明，巨噬細(xì)胞的功能改變會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)遭到破壞[26]；馬海航等[27]研究表明巨噬細(xì)胞的數(shù)量變化和活化與機(jī)體免疫功能改變密切相關(guān)。本研究考察了芪斛楂顆粒不同部位對(duì)巨噬細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，芪斛楂顆粒的Fr.A、Fr.B及Fr.C部位均對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖活性有促進(jìn)作用，而Fr.D部位對(duì)該細(xì)胞的增殖無影響，提示芪斛楂顆粒中極性中等和極性偏大的成分能夠促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖，小極性成分則不影響該細(xì)胞的增殖；在具有促進(jìn)細(xì)胞增殖活性的3個(gè)部位中，F(xiàn)r.A部位的作用最強(qiáng)，提示Fr.A為其主要活性部位，故而采用Fr.A部位進(jìn)行后續(xù)研究。

巨噬細(xì)胞的吞噬功能使其具有清除自身衰老細(xì)胞、殺滅外源性抗原及抗原提呈等的作用，是檢驗(yàn)其細(xì)胞功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[28]。本研究的中性紅吞噬試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)r.A部位可以顯著提高RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅染料的的能力，對(duì)其吞噬活性具有良好的促進(jìn)作用。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，其基本流程為：G0/G1→S→G2→M，處于不同周期的細(xì)胞，其內(nèi)部的DNA含量具有較大的差異[29]。對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)，可以反映出各周期階段的細(xì)胞比例，從而觀察藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響[30]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)r.A部位可以使處于G0/G1期的巨噬細(xì)胞比例增多，且其作用強(qiáng)度隨藥物質(zhì)量濃度的加大而增強(qiáng)，提示Fr.A部位可通過增加處于分裂初期或具有分裂潛質(zhì)階段的細(xì)胞比例而加速巨噬細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究初步探討了芪斛楂顆粒不同極性部位對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)芪斛楂顆粒中Fr.A、Fr.B及Fr.C部位均能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖，其中Fr.A部位活性最強(qiáng)可增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬活性，并增加處于G0/G1期的巨噬細(xì)胞比例，提示Fr.A部位可能是芪斛楂顆粒改善脾虛證相關(guān)癥狀的主要活性部位。