成興真，楊芳 ，王楊，聶微，劉澤瑩，王黔，嚴芝強**

(1.貴州醫(yī)科大學 外科學教研室,貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院 臨床血液教研室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 臨床檢驗中心，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 胃腸外科，貴州 貴陽 550004)

白蛋白紫杉醇(albumin-bound paclitaxel,Nab-PTX)是一種新型無溶劑的紫杉醇(paclitaxel,PTX)納米制劑，具有微管抑制劑的作用，其抗腫瘤原理是通過促進微管蛋白聚合以及穩(wěn)定微管導致腫瘤細胞停滯在 G2-M 期，最終導致有絲分裂細胞死亡[1-2]。目前Nab-PTX已廣泛用于乳腺癌、肺癌和胰腺癌等腫瘤的治療，但日本胃癌治療指南(最新版)指出 Nab-PTX可用于胃癌治療[3]，發(fā)現(xiàn)在可切除胃癌的圍手術期、腹膜轉移、進展期胃癌、不可切除及復發(fā)性胃癌等的治療中均表現(xiàn)出較好療效[4-7]，且國內(nèi)將 Nab-PTX應用于胃癌治療的臨床報道也表明 Nab-PTX抗腫瘤效果良好[8-13]。五氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)作為各大指南推薦的胃癌一線化療藥[3，14-15]，其作用機制為抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，從而阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉換為胸腺嘧啶核苷酸，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。目前關于Nab-PTX聯(lián)合5-Fu對胃癌細胞的研究較少，且尚無研究表明Nab-PTX聯(lián)合5-Fu對胃癌細胞周期的作用影響，因此本研究通過研究Nab-PTX聯(lián)合5-Fu對胃癌細胞(AGS)增殖及周期的影響，為胃癌用藥提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1細胞、試劑及藥物 胃癌細胞株AGS購于中國科學院細胞庫，RMPI 1640、PBS緩沖液、普通胰酶(含EDTA)及不含EDTA胰酶、胎牛血清均購于Biological Industries(BI，以色列)，Cell Counting Kit-8購于Dojindo Laboratories(日本)，流式細胞周期檢測試劑盒購自Becton,Dickinson and Company(BD，美國)，Nab-PTX購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，5-Fu購自天津金耀藥業(yè)有限公司。

1.1.2主要儀器 流式細胞儀Canto II plus (美國,Becton,Dickinson and Company)、酶標儀Varioskan LUX (美國,Thermo scientific)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的 RMPI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞株AGS，并置于含 5% CO2的濕潤空氣以及37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；胰酶(含EDTA)消化處于對數(shù)生長期的細胞，用完全培養(yǎng)基重懸成細胞單懸液，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖情況 將處于對數(shù)生長期的AGS 細胞以 1×104/孔接種于96孔板中，每孔加入200 μL完全培養(yǎng)基。24 h后去除培養(yǎng)基，PBS洗滌3次并向Nab-PTX組加入 Nab-PTX(濃度梯度為0.1、0.2、0.4 μmol/L)，5-Fu組加入5-Fu(濃度梯度分別為1、2、4 μmol/L)，Nab-PTX+5-Fu組加入Nab-PTX+5-Fu[濃度梯度分別為(0.1+1)、(0.2+2)、(0.4+4)μmol/L]，各200 μL,將只含200 μL RMPI 1640培養(yǎng)基的對數(shù)生長的AGS細胞作為對照組(Ctrl組)，僅含200 μL RMPI 1640 培養(yǎng)基(不含AGS細胞)作為空白組。每組設置5個復孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，去原培養(yǎng)液；用 PBS 洗滌3次，加入100 μL的 RPMI 1640 培養(yǎng)液、每個孔10 μL CCK-8 溶液,在 37 °C 含 5 % CO2孵箱孵育1.5 h，使用酶標儀在吸光度為 450 nm 波長處測量吸光度。實驗重復3次，計算細胞增殖存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.3流式細胞術分析細胞周期 取 2×105個對數(shù)期的AGS細胞，接種于6孔板中,待生長至80%時,分別加入 Nab-PTX(0.2 μmol/L)、5-Fu(2 μmol/L)、Nab-PTX+5-Fu[(0.2+2)μmol/L]；培養(yǎng)細胞24 h，用預冷PBS洗滌3次，加入不含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化，離心后收集細胞；收集細胞后加入 4 ℃ 預冷的70%乙醇固定24 h，1 000 r/min離心后去上清，使用預冷 PBS 洗滌細胞 3 次，后加入 500 μL Staining Buffer、25 μL PI、10 μL RNA 酶，避光 37 ℃ 水浴 30 min 后上機檢測，計算每組細胞所處G0/G1、S以及G2/M期的比例，評估每組細胞的周期阻滯情況，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 細胞增殖

培養(yǎng)72 h時,與Ctrl組比較，Nab-PTX組(0.4 μmol/L)、5-Fu組(2、4 μmol/L)及Nab-PTX+5-Fu組[(0.1+1)、(0.2+2)、(0.4+4)μmol/L]細胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；結果顯示，與Ctrl組比較，同一時間點(培養(yǎng)72 h)不同濃度的Nab-PTX組、5-Fu組、Nab-PTX+5-Fu組細胞存活率增殖能力均受到抑制，且隨濃度增加，細胞增殖存活率下降。同一濃度[Nab-PTX組(0.2 μmol/L)、5-Fu組(2 μmol/L)、Nab-PTX+5-Fu組(0.2+2)μmol/L]不同作用時間，各組細胞的存活率隨著時間的延長而下降，其中培養(yǎng)24 h時的Nab-PTX組和Nab-PTX+5-Fu組，培養(yǎng)48 h 時的5-Fu組和Nab-PTX+5-Fu組，培養(yǎng)72 h 時的3組與對應時點的Ctrl組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示Nab-PTX、5-Fu、Nab-PTX+5-Fu抑制AGS細胞的增殖具有劑量-時間依賴性，Nab-PTX+5-Fu組較Nab-PTX組、5-Fu組能更有效抑制AGS細胞的增殖。見圖1。

注：A為 Nab-PTX、5-Fu、Nab-PTX+5-Fu不同濃度作用72 h對AGS細胞增殖能力的影響變化；B為Nab-PTX(0.2 μmol/L)、5-Fu(0.2 μmol/L)、Nab-PTX+5-Fu(0.2+2 μmol/L)作用不同時間對AGS細胞增殖能力的影響變化；(1)與Ctrl組相比，P<0.05。圖1 各組AGS細胞抑制率(CCK-8)Fig.1 Cell inhibition rates of AGS in each group (CCK-8)

2.2 細胞周期

流式細胞術檢測細胞周期結果顯示：各組處理24 h后，與Ctrl組相比，5-Fu組G0/G1期比例明顯減少、S期比例明顯增加，Nab-PTX組及Nab-PTX+5-Fu組G2/M期比例明顯增加，組間對比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Ctrl組相比，Nab-PTX組及Nab-PTX+5-Fu組G0/G1期比例明顯減少，Nab-PTX+5-Fu組S期比例明顯增加，5-Fu組G2/M期比例明顯減少，組間對比結果極具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。由此可見，Nab-PTX組使AGS細胞周期阻滯在G2/M期，5-Fu組使細胞周期阻滯于S期，Nab-PTX+5-Fu組使AGS細胞周期阻滯在S期，且Nab-PTX+5-Fu組S期比例較5-Fu組增加，G2/M期較Nab-PTX組明顯減少。見圖2。

3 討論

目前胃癌的物治療仍以化療或新輔助化療為主，當前各大指南推薦的化療藥物主要為5-Fu及其衍生物、鉑類、PTX及其衍生物等，而化療藥物的耐藥性成為胃癌有效治療的主要障礙[17]。實驗研究及臨床試驗表明Nab-PTX在胃癌治療中有明顯作用[7，18-19 ]，作為PTX制劑衍生物，Nab-PTX的抗腫瘤機制主要是誘導和促進微管蛋白聚合，抑制其解聚，進而有效抑制細胞有絲分裂過程中紡錘體及紡錘絲的形成，故導致腫瘤細胞發(fā)育在G2-M期受到阻滯和在有絲分裂時發(fā)生死亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。與PTX相比，Nab-PTX的優(yōu)勢在于不僅完全避免了激素脫敏處理，還改變了體內(nèi)藥代動力學特征、提高了患者的耐受劑量，提高藥物在腫瘤組織中蓄積[20-21]。一項三期臨床試驗結果表明，Nab-PTX每周1次用藥的生存率不遜于PTX每周1次用藥的生存率,這種優(yōu)勢使其成為胃癌二線治療的潛在方案[19]。

注：A為Ctrl組AGS細胞，B為Nab-PTX組AGS細胞，C為5-Fu組AGS細胞，D為Nab-PTX+5-Fu組AGS細胞，E為各組AGS細胞24 h結果統(tǒng)計圖；與Ctrl組相比，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖2 Nab-PTX、5-Fu、Nab-PTX+5-Fu作用24 h對AGS細胞周期的影響Fig.2 The effects of Nab-PTX,5-Fu ,and Nab-PTX+5-Fu treatment for 24 h on AGS cell cycle

有研究表明，從3例胃癌患者手術標本建立的人胃癌器官模型的研究中，Nab-PTX半數(shù)抑制率(IC50)明顯低于5-Fu及表柔比星，且隨著 Nab-PTX作用時間增加，腫瘤細胞的凋亡率明顯增加，Nab-PTX具有較強的抗腫瘤活性，可望成為治療GC患者的一線藥物[22]；研究還發(fā)現(xiàn)，Nab-PTX較5-Fu更能抑制腫瘤細胞增殖，且同樣表現(xiàn)出隨作用時間增加抑制率增加的現(xiàn)象。在本研究中發(fā)現(xiàn)，Nab-PTX聯(lián)合5-Fu作用于胃癌細胞，誘導細胞凋亡率高于 Nab-PTX、5-Fu單獨應用時；且有研究證實，在胰腺癌細胞中，吉西他濱和 Nab-PTX聯(lián)合作用，可增強兩種藥物的細胞毒性作用，從而降低其劑量，減少不良反應的發(fā)生[23]。由此推測，在將來胃癌的臨床治療中，Nab-PTX聯(lián)合5-Fu較 Nab-PTX或5-Fu單藥有更好的抗腫瘤作用。

眾所周知，細胞周期須經(jīng)歷DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期),DNA合成后期(G2期)以及細胞有絲分裂期(M期)，這些過程又可以劃分為DNA復制與染色體分裂兩個部分，而在整個增殖過程中，有著嚴密精確的調(diào)控機制，如CDKs正向調(diào)節(jié)細胞周期，同時CDKs依賴cyclins,cyclinD與CDK4/6結合在G1期末期發(fā)揮作用，細胞由G1期過渡到S期則需cyclinE與CDK2結合[24]，CDK2與cyclinB結合將促使細胞從S期進入G2期，進入M期則需要cyclinA與CDK1結合。在細胞周期中，生長因子發(fā)揮著重要作用，但同時細胞周期也受到CKIs的反向調(diào)控作用，其發(fā)揮作用的機制主要是抑制CDKs與cyclins的結合。細胞周期的正常進行，需在CDKs、cyclins、CKIs共同協(xié)調(diào)下完成，其監(jiān)控途徑又主要由在G1期向S期轉化起首要作用的pRb和DNA損傷檢查點上的p53發(fā)揮作用[25-27]。在胰腺癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Nab-PTX與吉西他濱聯(lián)用增強了細胞在S期的積累，由于在S期積累的細胞增加，導致G2期細胞的急劇減少[23]。同時通過對細胞周期信號蛋白的檢測，發(fā)現(xiàn)cyclinD1水平不受治療影響，而吉西他濱單獨或與 Nab-PTX聯(lián)合使用后，cyclinA2和cyclinE2水平升高。Nab-PTX聯(lián)合吉西他濱與吉西他濱單獨用藥相比，其cyclinB1的表達降低[23]。而cyclinB1參與S-G2細胞周期轉變[25]，由此也佐證了聯(lián)合用藥G2/M期細胞的減少。由此推測 Nab-PTX似乎干擾細胞S期的早期階段。本研究證實，Nab-PTX能將 AGS細胞株的細胞周期阻滯在G2/M期、5-Fu細胞周期阻滯發(fā)生在S期、Nab-PTX聯(lián)合5-Fu使細胞周期阻滯則發(fā)生在S期；相較于5-Fu單藥，Nab-PTX聯(lián)合5-Fu能使更多細胞阻滯于S期，由此推測Nab-PTX聯(lián)合5-Fu作用于胃癌細胞，一方面可能通過激活cyclinA2和cyclinE2表達 ，使細胞阻滯在S期；Nab-PTX還可加強5-Fu對DNA的損傷作用，激活p53抑制CDK2與cyclinB，Nab-PTX同時激活Rb，使細胞周期不能順利進入M期[27]。

綜上所述，Nab-PTX與5-Fu聯(lián)合用藥不僅能有效抑制細胞增殖，其抑制細胞增殖隨劑量及時間增加而增加，研究結果可為 Nab-PTX廣泛應用于胃癌治療提供數(shù)據(jù)參考，而 Nab-PTX與5-Fu聯(lián)合用藥使細胞周期阻滯在S期，但其潛在機制有待進一步探索。