洪曉泉 傅錦波 林福生 羅曄哲 林恩德

（廈門大學附屬中山醫(yī)院普通外科 福建廈門361004）

結直腸癌（Colorectal Cancer）是近年來發(fā)病率和病死率上升顯著的一類癌癥，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率位居第三，病死率位居第四，且在發(fā)達國家和地區(qū)更為多見[1～3]。鳶尾黃酮（Tectorigenin）是鳶尾科植物射干中的一種成分，研究表明其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種作用，并可能對細胞自噬過程存在影響[4～6]。自噬性死亡（Autophagic Cell Death）是指依賴于自噬過程的程序性細胞死亡。對細胞自噬過程的干預可能導致細胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制的失衡，從而導致細胞死亡[7～9]。本研究分析了鳶尾黃酮對結腸癌細胞自噬水平的影響，并通過聯(lián)合使用抑制劑及下調(diào)自噬過程關鍵蛋白探究鳶尾黃酮對結腸癌細胞增殖活性及凋亡的影響?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 細胞株來源和制劑 人結腸癌細胞株SW480和正常人結腸細胞系CCD 841 CoN購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection,ATCC）。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗購自美國Hyclone公司。鳶尾黃酮購自Sigma-Aldrich公司。凋亡抑制劑Z-VAD-FMK（S7023）、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（S7243）、壞死性凋亡抑制劑（S8037）購自美國Selleck公司。CCK-8試劑購自博士德公司。兔抗人p62（#8025）、兔抗人LC3（#3868）抗體購自美國CST公司，鼠抗人GAPDH（#AC033）購自武漢愛博泰克公司。Trizol、Lipofectamine 2 000試劑購自美國Thermo Fisher公司。SiATG5及siNC由銳博生物科技有限公司負責構建。

1.2 研究方法

1.2.1 人結腸癌細胞系SW480細胞培養(yǎng) 在加入雙抗的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2天更換新鮮培養(yǎng)基或進行細胞傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活性及半抑制濃度（IC50）曲線的繪制 取對數(shù)生長期的人結腸癌細胞SW480和正常人結腸細胞系CCD 841 CoN，以10^4 CCU/ml的密度種于96孔板中并加入100μl培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后吸取上清液，分別加入100μl含不同濃度鳶尾黃酮及相應抑制劑的培養(yǎng)基，以加入二甲基亞砜（DMSO）組作為陰性對照，僅加培養(yǎng)基組作為空白對照，每組設5個復孔。待培養(yǎng)24 h后吸棄上清，每孔加入10μl CCK-8液及100μl培養(yǎng)基，37℃孵育1 h后于酶標儀波長450 nm處讀取吸光度（OD）值。根據(jù)吸光度值計算細胞增殖的相對速率，以鳶尾黃酮濃度作為橫軸，細胞增長抑制率作為縱軸，擬合出IC50曲線，曲線上抑制率為50%的點所對應的濃度即為鳶尾黃酮在SW480細胞系和正常人結腸細胞系CCD 841 CoN中的IC50值。

1.2.3 Western blot法檢測自噬相關蛋白表達情況取對數(shù)生長期的人結腸癌細胞SW480，分別加入50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L鳶尾黃酮，并以加入DMSO作為對照組。作用24 h后以放射免疫沉淀法（Radio-Immunoprecipitation Assay,RIPA）提取蛋白，檢測蛋白濃度并根據(jù)濃度調(diào)整上樣量，經(jīng)電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉后以LC3、p62及GAPDH一抗4℃孵育過夜、TBST洗膜3次后，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后采用增強化學發(fā)光法（ECL）曝光。

1.2.4 透射電鏡觀察結腸癌細胞內(nèi)自噬體數(shù)量取對數(shù)生長期的人結腸癌細胞SW480于6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞貼壁后加入200μmol/L鳶尾黃酮作用24 h，對照組加入等量DMSO。培養(yǎng)24 h后棄去上清，加入2.5%戊二醛，用細胞刮刮下細胞收集入EP管中，離心棄上清后以2.5%戊二醛重懸，并于4℃固定。經(jīng)鋨酸固定、丙酮逐級脫水、環(huán)氧樹脂包埋后作超薄切片，染色后于透射電鏡下觀察細胞的超微結構變化。取4個視野下結腸癌細胞SW480內(nèi)自噬體的平均數(shù)量進行對比。

1.2.5 小干擾RNA（siRNA）沉默自噬關鍵蛋白ATG5轉染 取對數(shù)生長期的結腸癌細胞SW480種于6孔板中，待細胞密度達到70%左右時，使用Lipofectamine2000將siATG5及對應的陰性對照物（siNC）轉染入細胞，24 h后換液，48 h時取部分細胞提取RNA并確認轉染效率，剩余細胞重新種板，待貼壁后，取siATG5及siNC組加入200μmol/L鳶尾黃酮，另取siNC組加入DMSO作為對照。分別使用或不使用Z-VAD預處理并作用24 h后用CCK-8法（同1.2.2）檢測細胞增殖活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有實驗均設3次重復，實驗數(shù)據(jù)的分析處理采用SPSS23.0軟件，柱狀圖及曲線繪制采用Graphpad Prism7軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鳶尾黃酮在結腸癌細胞系SW480和正常人結腸細胞系CCD 841 CoN中的IC50比較 使用CCK-8法分析不同濃度鳶尾黃酮作用下結腸癌細胞系SW480的生長抑制情況，繪制得出對應的IC50曲線，通過曲線進一步得出SW480細胞系中鳶尾黃酮的IC50為（221.90±35.31）μM，CCD 841CoN細胞系中鳶尾黃酮的IC50為（327.50±7.89）μM。見圖1。

圖1 鳶尾黃酮作用于SW480和CCD 841 CoN細胞的IC50曲線

2.2 鳶尾黃酮作用于SW480細胞的克隆平板實驗結果 根據(jù)2.1中的IC50結果，將鳶尾黃酮的作用濃度定為200μM。克隆平板實驗表明，鳶尾黃酮對結腸癌細胞的長期增殖能力具有抑制作用。其中，對照組克隆形成個數(shù)平均為（219.00±7.94）個，鳶尾黃酮作用組克隆形成個數(shù)平均為（133.30±6.33）個，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.436，P＜0.01），說明鳶尾黃酮抑制了結腸癌細胞SW480的長期增殖能力。見圖2。

圖2 鳶尾黃酮作用于SW480細胞的克隆平板實驗結果

2.3 不同抑制劑預處理后鳶尾黃酮作用下SW480細胞活性檢測結果 為進一步明確鳶尾黃酮抑制結腸癌細胞系SW480增殖能力的機制，分別使用凋亡抑制劑Z-VAD（50μM）、鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（1μM）、壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1（1μM）預處理SW480細胞1 h后，加入200μM鳶尾黃酮繼續(xù)作用24 h。結果表明凋亡抑制劑Z-VAD顯著逆轉了鳶尾黃酮對結腸癌細胞的增殖抑制作用，其中鳶尾黃酮單藥作用組平均吸光度為（0.82±0.04），Z-VAD預處理組平均吸光度為（1.25±0.04），差異有統(tǒng)計學意義（t=11.12，P＜0.01），說明鳶尾黃酮激活了結腸癌細胞系SW480的凋亡。而Ferrostatin-1、Necrostatin-1預處理組與鳶尾黃酮單藥作用組無明顯差異（P＞0.05）。見圖3。

圖3 不同抑制劑預處理后鳶尾黃酮作用下SW480細胞活性檢測

2.4 Western blot檢測不同濃度鳶尾黃酮作用后SW480細胞內(nèi)自噬相關蛋白變化情況 使用Western blot檢測0μM、50μM、100μM、200μM鳶尾黃酮作用24 h后結腸癌細胞系SW480中自噬相關蛋白的變化情況，結果表明，隨著鳶尾黃酮作用濃度的升高，SW480細胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白水平逐漸增高，p62逐漸降低，提示鳶尾黃酮作用后SW480細胞的自噬被激活。見圖4。

圖4 鳶尾黃酮作用于SW480細胞后蛋白免疫印跡法檢測自噬相關蛋白含量的變化情況

2.5 SW480細胞內(nèi)自噬體數(shù)量變化情況電鏡觀察結果 采用透射電鏡分別對200μM鳶尾黃酮作用24 h后以及未經(jīng)處理的SW480細胞進行觀察，結果表明，鳶尾黃酮作用后SW480細胞內(nèi)自噬體數(shù)量明顯增多。其中，對照組SW480細胞內(nèi)自噬體數(shù)量平均為（5.00±1.16）個，200μM鳶尾黃酮作用24 h后的SW480細胞內(nèi)自噬體數(shù)量平均為（29.67±2.91）個，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.888，P＜0.01）。見圖5。

圖5 鳶尾黃酮作用于SW480細胞后其細胞內(nèi)自噬體數(shù)量變化情況電鏡觀察結果

2.6 沉默ATG5聯(lián)合Z-VAD作用下鳶尾黃酮作用于SW480細胞的細胞活性檢測結果 分別使用siATG5和siNC對SW480細胞進行轉染，48 h后提取細胞核糖核酸（RNA），用qPCR進行ATG5表達量檢測以驗證敲低效率，結果顯示siATG5組ATG5相對表達量為（0.42±0.03）。使用上述驗證過的siATG5和siNC質(zhì)粒對SW480細胞進行瞬時轉染，伴或不伴Z-VAD預處理的情況下加入200μM鳶尾黃酮或等量DMSO，作用24 h后使用CCK-8法檢測SW480細胞的增殖活性。結果表明，鳶尾黃酮的殺傷作用在轉染了siATG5的SW480細胞中受到了抑制，沉默ATG5抑制了鳶尾黃酮對結腸癌細胞的殺傷作用。其中，鳶尾黃酮作用于siNC對照組平均吸光度為（0.94±0.04），作用于siATG5實驗組平均吸光度為（1.42±0.06），差異有統(tǒng)計學意義（t=9.225，P＜0.01）。同時，siATG5聯(lián)合Z-VAD預處理實驗組平均吸光度為（1.42±0.04），與僅轉染siATG5的實驗組相比，未見明顯統(tǒng)計學差異（t=0.516，P＞0.05）。表明Z-VAD預處理并未在轉染了siATG5的結腸癌細胞中進一步抑制鳶尾黃酮的殺傷作用。見圖6。

圖6 沉默ATG5聯(lián)合Z-VAD作用下鳶尾黃酮作用于SW480細胞的細胞活性檢測結果

3 討論

隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，我國結腸癌的發(fā)病率正逐年上升，且城市地區(qū)遠高于農(nóng)村[10～11]。結腸癌早期可無明顯癥狀，多數(shù)病人發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，其總體發(fā)病率在惡性腫瘤中處于前列，盡管醫(yī)療工作者在治療上進行了諸多嘗試，但結腸癌仍然是威脅生命安全的主要惡性腫瘤之一，對化療藥物的耐藥是結腸癌治療中面臨的主要問題[12～14]。結腸癌的病因學涉及遺傳及環(huán)境因素，而一些新的有機化合物通過不同的機制調(diào)節(jié)細胞應答并發(fā)揮其抗癌作用，這些機制包括調(diào)節(jié)凋亡、自噬、抑制血管生成以及上調(diào)抑癌基因等[15～17]。有研究表明，鳶尾黃酮可以通過NF-κB和MAPK通路抑制增殖而起到抗腫瘤的作用，此外，其在小鼠巨噬細胞中還能抑制干擾素γ/脂多糖導致的炎癥反應。同時，其對細胞自噬過程可能存在影響[18～20]。自噬是細胞調(diào)節(jié)環(huán)境和遺傳壓力的基本反應機制，兩種途徑相互聯(lián)系，并調(diào)節(jié)腫瘤細胞對環(huán)境刺激的反應[21～23]。本研究著重探究了鳶尾黃酮作用后結腸癌細胞增殖及自噬情況的變化，并通過下調(diào)自噬過程關鍵基因ATG5，探究鳶尾黃酮對結腸癌細胞增殖的抑制作用與其對自噬的影響是否有關。

本研究通過CCK-8法對不同濃度鳶尾黃酮作用下結腸癌細胞的增殖能力進行了測定，并繪制出了IC50曲線，結果表明鳶尾黃酮在結腸癌細胞SW480中的IC50約為（221.90±35.31）μM。同時，我們也通過同樣的方法繪制了鳶尾黃酮作用于正常人結腸細胞系的IC50曲線，得到鳶尾黃酮在正常人結腸細胞系CCD 841 CoN的半抑制濃度約為（327.50±7.89）μM，表明鳶尾黃酮對結腸癌細胞更敏感，而對正常人結腸細胞具有更小的毒性。隨后我們通過克隆平板實驗，進一步確認了鳶尾黃酮對結腸癌細胞長期增殖能力的抑制作用。并且，通過使用不同抑制劑的預處理，我們發(fā)現(xiàn)凋亡抑制劑Z-VAD顯著逆轉了結腸癌細胞的死亡，而鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1（1μM）和壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1（1μM）對其抑制作用無明顯效應，表明鳶尾黃酮激活了結腸癌細胞的凋亡通路。Western blot結果表明鳶尾黃酮作用后細胞內(nèi)自噬標記蛋白LC3-Ⅱ含量上升，而自噬降解底物蛋白p62表達下降；同時，透射電鏡觀察到鳶尾黃酮作用后結腸癌細胞中自噬體的數(shù)量明顯增加，表明鳶尾黃酮激活了結腸癌細胞的自噬過程。

ATG5被認為是自噬過程中的關鍵調(diào)節(jié)蛋白。其在自噬體的形成過程中起著至關重要的作用，ATG5缺失或突變的細胞將不能有效地形成自噬體[24～26]。本研究通過向結腸癌細胞中轉染siATG5使ATG5蛋白表達量下降，從而抑制了細胞的自噬作用，并聯(lián)合鳶尾黃酮作用后發(fā)現(xiàn)其對結腸癌細胞的殺傷作用明顯減弱。由此我們認為，鳶尾黃酮對結腸癌細胞的殺傷與其激活自噬過程存在聯(lián)系。既往研究表明自噬是細胞在外界應激條件下對細胞內(nèi)組分進行吞噬和清除的過程[27～28]。當細胞內(nèi)自噬過度激活時，由于胞內(nèi)成分被過度吞噬和消化，將會引起細胞的自噬性死亡[29～31]。同時，轉染siATG5后聯(lián)合使用凋亡抑制劑Z-VAD并未進一步逆轉鳶尾黃酮對結腸癌細胞的殺傷作用，表明鳶尾黃酮很可能通過促進細胞自噬進而激活了結腸癌細胞的凋亡通路，從而引起結腸癌細胞的凋亡。綜上所述，鳶尾黃酮通過促進細胞自噬抑制了結腸癌細胞的增殖，并激活其凋亡通路。鳶尾黃酮對自噬過程的影響有望使其成為抗結腸癌治療的候選藥物。