巫夢雪 杜薇娜 王 曼 熊國平

卵巢癌是最常見的女性癌癥類型之一，治療手段主要包括手術(shù)治療、放療、免疫治療、化療[1]。盡管近年來卵巢癌的診斷和治療得到了較大的發(fā)展，由于其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率很高，多數(shù)患者療效不佳，5年生存率很低[2]。篩選合適的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)是監(jiān)測和干預(yù)卵巢癌發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵。微小RNA(miRNA)由18～25個核苷酸構(gòu)成的內(nèi)源性小分子RNA，在基因的轉(zhuǎn)錄過程發(fā)揮重要調(diào)控作用[3,4]。多項研究顯示，惡性腫瘤組織和細(xì)胞中均存在miRNA差異表達(dá)，miRNA通過抑制抑癌基因或癌基因的翻譯過程，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷移、耐藥性、增殖等生物學(xué)行為[5,6]。miR-3614-5p屬于miR-3614家族，是定性明確的抑癌基因[7,8]。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-3614-5p的表達(dá)水平降低，miR-3614-5p能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。目前，有關(guān)miR-3614-5p在卵巢癌中的研究很少。本研究旨在探討miR-3614-5p在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)，觀察miR-3614-5p對卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，明確miR-3614-5p參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。

材料與方法

1.細(xì)胞與試劑：人卵巢癌細(xì)胞系(SKOV-3、OVCAR-3、A2780、HO-8910、OC3)和人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80購自美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。miR-3614-5p模擬物、miR-NC模擬物、雙熒光素酶報告基因載體psiCHECK2(GNAI2-m、GNAI2-w)、PCR引物購自上海吉瑪生物制藥有限公司。一抗GNAI2、β-tubulin、p-AKT、RHEB、p-mTOR和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國CST公司。CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Amresco公司。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)相關(guān)試劑盒購自日本TaKaRa公司。Transwell小室購自美國Corning公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：SKOV-3、A2780、HO-8910和IOSE80細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，OVCAR-3、OC3細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的OVCAR-3細(xì)胞，嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將miR-3614-5p模擬物(miR-3614-5p組)、miR-NC模擬物(對照組)轉(zhuǎn)染至OVCAR-3細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

3.qRT-PCR檢測miR-3614-5p和GNAI2信使RNA(mRNA)相對表達(dá)量：TRIzol法提取收集卵巢癌細(xì)胞系和正常卵巢上皮細(xì)胞總RNA，每個樣本選擇2μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以U6作為對照，qRT-PCR檢測miR-3614-5p相對表達(dá)量；以GAPDH作為對照，qRT-PCR檢測GNAI2 mRNA相對表達(dá)量。qRT-PCR引物序列如下，U6上游引物為5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-3614-5p上游引物為5′- AACAAGCCACTTGGATCTGAAGG -3′，下游引物為5′- CAGTGCAGGGTCCGAGGT -3′；GNAI2上游引物為5′- TACCGGGCGGTTGTCTACA-3′，下游引物為5′- GGGTCGGCAAAGTCGATCTG-3′；GAPDH上游引物為 5′- ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′- GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。采用2-ΔΔCt方法計算miR-3614-5p和GNAI2 mRNA相對表達(dá)量。

4.生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合雙熒光素酶報告基因法驗證miR-3614-5p的靶基因：利用miRecords和DIANA-microT在線預(yù)測軟件預(yù)測miR-3614-5p可能的靶基因。將對數(shù)生長期的OVCAR-3細(xì)胞接種于24孔板，通過Lipofectamine 2000分別將GNAI2-m和miR-NC、GNAI2-w和miR-NC、GNAI2-m和miR-3614-5p、GNAI2-w和miR-3614-5p瞬時轉(zhuǎn)染OVCAR-3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h。根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作，通過多功能酶標(biāo)儀讀取各組的熒光值，計算各組的相對熒光素酶活性。

5.Western blot法檢測GNAI2蛋白和和AKT/mTOR信號通路蛋白表達(dá)變化：取各組轉(zhuǎn)染48h的OVCAR-3細(xì)胞，提取總蛋白并測定蛋白濃度。每組上樣35μg蛋白于SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，采用半濕法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜，在2%脫脂牛奶中室溫封閉4h。稀釋一抗GNAI2(1∶3000稀釋)、β-tubulin(1∶3000稀釋)、p-AKT(1∶2000稀釋)、RHEB(1∶2000)及p-mTOR(1∶2000)，添加一抗并在4℃孵育15h。稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)，添加二抗并在室溫孵育1.5h。配制化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光、采集圖像。

6.CCK-8檢測OVCAR-3細(xì)胞增殖能力：取各組轉(zhuǎn)染48h的OVCAR-3細(xì)胞，以每孔2×103個細(xì)胞(150μl)接種到96孔板，每組5個復(fù)孔。加入15微升/孔CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h，通過多功能酶標(biāo)儀讀取每孔在450nm波長處的吸光度(A)值。按照CCK-8試劑盒說明書連續(xù)5天進(jìn)行檢測，繪制OVCAR-3細(xì)胞生長曲線。

7.Transwell遷移實驗檢測OVCAR-3細(xì)胞遷移能力：取各組轉(zhuǎn)染48h的OVCAR-3細(xì)胞，取4×105個/毫升的OVCAR-3細(xì)胞以150μl接種于Transwell小室上室，在下室添加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基750μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h。采用棉棒擦去上室上表面的細(xì)胞，使用甲醇溶液固定20min，使用0.1%的結(jié)晶紫溶液染色15min，于倒置顯微鏡下計數(shù)4個單獨(dú)視野下的染色細(xì)胞數(shù)，其均值代表OVCAR-3細(xì)胞的遷移能力。

結(jié) 果

1.miR-3074-5p表達(dá)水平與卵巢癌患者生存期的關(guān)系：與miR-3074-5p表達(dá)較低的卵巢癌患者比較，miR-3074-5p表達(dá)較高的患者生存期較長(P<0.05,圖1)。

圖1 miR-3074-5p表達(dá)水平與卵巢癌患者生存期的關(guān)系

2.miR-3614-5p在卵巢癌細(xì)胞系和正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)：qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞(SKOV-3、OVCAR-3、A2780、HO-8910、OC3)及正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80中miR-3614-5p的表達(dá)分別為0.58±0.02、0.22±0.03、0.40±0.06、0.69±0.05、0.59±0.09和1.01±0.09。與IOSE80細(xì)胞比較，miR-3614-5p在卵巢癌細(xì)胞系表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，miR-3614-5p表達(dá)最低的細(xì)胞是OVCAR-3細(xì)胞(P<0.01，圖2)。

圖2 miR-3614-5p在卵巢癌細(xì)胞系和正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)與IOSE80細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.轉(zhuǎn)染后OVCAR-3細(xì)胞中miR-3614-5p表達(dá)：miR-3614-5p組和對照組OVCAR-3細(xì)胞中miR-3614-5p表達(dá)分別為9.96±1.04和0.98±0.16，miR-3614-5p組是對照組的10.16倍(P<0.01)。

4.miR-3614-5p對OVCAR-3細(xì)胞增殖能力的影響：CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-3614-5p組OVCAR-3細(xì)胞在第2、3、4、5天的吸光度值明顯降低(P<0.05，圖3)。

圖3 miR-3614-5p對OVCAR-3細(xì)胞增殖能力的影響與對照組比較，*P<0.05

5.miR-3614-5p對OVCAR-3細(xì)胞遷移能力的影響：Transwell遷移實驗顯示，miR-3614-5p組和對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為30.53±9.03個和102.70±12.87個，miR-3614-5p組顯著少于對照組(P<0.01，圖4)。

圖4 miR-3614-5p對OVCAR-3細(xì)胞遷移能力的影響A.Transwell實驗鏡下圖(結(jié)晶紫染色，×100)；B.Transwell實驗定量結(jié)果

6.生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-3614-5p的靶基因：利用miRecords和DIANA-microT在線預(yù)測軟件對miR-3614-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-3614-5p可能與GNAI2 mRNA的3′非翻譯區(qū)存在潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖5)。

圖5 miR-3614-5p與GNAI2 mRNA3′非翻譯區(qū)的序列配對分析

7. 雙熒光素酶報告基因法驗證miR-3614-5p的靶基因：雙熒光素酶報告基因法顯示，GNAI2-w+miR-NC組和GNAI2-w+miR-3614-5p組相對熒光酶活性分別是1.01±0.12和0.23±0.07，轉(zhuǎn)染miR-3614-5p能明顯降低轉(zhuǎn)染GNAI2-w的OVCAR-3細(xì)胞的相對熒光素酶活性(P<0.01,圖6)。

圖6 雙熒光素酶報告基因法驗證miR-3614-5p的靶基因

8.miR-3614-5p對OVCAR-3細(xì)胞中GNAI2 mRNA表達(dá)的影響：qRT-PCR法檢測結(jié)果顯示，miR-3614-5p組和對照組OVCAR-3細(xì)胞中GNAI2 mRNA表達(dá)分別為0.24±0.06和1.03±0.09，高表達(dá)miR-3614-5p顯著抑制GNAI2 mRNA的表達(dá)(P<0.01)。

9.高表達(dá)miR-3614-5p對GNAI2蛋白和AKT/mTOR信號通路蛋白表達(dá)的影響：Western blot法檢測結(jié)果顯示，高表達(dá)miR-3614-5p后，GNAI2蛋白表達(dá)下調(diào)，AKT/mTOR信號通路蛋白如p-AKT、RHEB、p-mTOR的表達(dá)明顯降低，AKT/mTOR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制(圖7)。

圖7 高表達(dá)miR-3614-5p對OVCAR-3細(xì)胞GNAI2蛋白和AKT/mTOR信號通路蛋白表達(dá)的影響

討 論

miRNA在真核細(xì)胞生物體內(nèi)高度保守，其在細(xì)胞分化、發(fā)育及生長過程起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[9]。近年來研究顯示，miRNA在卵巢癌組織和細(xì)胞中表達(dá)異常，與卵巢癌的形成密切相關(guān)[10～12]。Zeng等[13]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可以上調(diào)卵巢癌細(xì)胞系中miR-125a-5p的表達(dá)，miR-125a-5p高表達(dá)可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Xiao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，let-7e是卵巢癌患者無進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素，let-7e表達(dá)失調(diào)可通過影響DNA雙鏈斷裂修復(fù)促進(jìn)順鉑的耐藥，恢復(fù)let-7e表達(dá)可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感度。Han等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-3614-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低，其低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者TNM分期、腫瘤類型、淋巴浸潤顯著相關(guān)，miR-3614-5p低表達(dá)的患者總生存率較低。

本研究比較了卵巢癌細(xì)胞系和正常卵巢上皮細(xì)胞miR-3614-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞系中miR-3614-5p的表達(dá)明顯低于正常卵巢上皮細(xì)胞，說明miR-3614-5p可能參與了卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究進(jìn)一步觀察了miR-3614-5p在卵巢癌中的生物學(xué)功能，結(jié)果顯示，miR-3614-5p組卵巢癌細(xì)胞的增殖水平和遷移能力降低，提示miR-3614-5p在卵巢癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌作用。miRNA主要以堿基互補(bǔ)配對的方式結(jié)合靶基因mRNA，并且依據(jù)互補(bǔ)配對的程度，抑制mRNA的翻譯或者直接降解mRNA[15,16]。

本研究應(yīng)用miRecords和DIANA-microT在線預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-3614-5p與G蛋白α抑制劑2(G protein alpha inhibiting activity polypeptide 2，GNAI2)mRNA3′非翻譯區(qū)存在潛在結(jié)合位點(diǎn)。GNAI2蛋白是一種G蛋白家族抑制型蛋白，通過降低腺苷酸環(huán)化酶活性，影響多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。GNAI2蛋白已被公認(rèn)為促癌蛋白，結(jié)腸癌、前列腺癌、食管鱗癌等多種惡性腫瘤中均存在GNAI2蛋白的陽性表達(dá)，且GNAI2蛋白在低分化腫瘤組織中的表達(dá)高于中高分化組織，GNAI2蛋白表達(dá)陽性的患者臨床分期較晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高、生存率較低[18,19]。Fu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，GNAI2蛋白在卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯增加，GNAI2蛋白能夠通過促進(jìn)AKT/mTOR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，沉默GNAI2表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明miR-3614-5p可互補(bǔ)結(jié)合GNAI2 mRNA。本研究中，對OVCAR-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-3614-5p模擬物，miR-3614-5p能夠在mRNA和蛋白水平抑制GNAI2的表達(dá)。miR-3614-5p負(fù)性調(diào)控GNAI2蛋白活性后，AKT/mTOR信號通路蛋白如p-AKT、RHEB、p-mTOR的表達(dá)明顯降低，AKT/mTOR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制。

綜上所述，miR-3614-5p在卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)降低，miR-3614-5p通過作用于GNAI2基因mRNA對該基因進(jìn)行靶向負(fù)調(diào)控，阻滯AKT/mTOR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的增殖和遷移過程。miR-3614-5p可能為卵巢癌的miRNA靶向治療提供新的靶點(diǎn)。