劉 鵬 王從容

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一種嚴重的自身免疫疾病，主要以T淋巴細胞介導的β細胞破壞為主要特征，可導致胰島素分泌絕對不足，引發(fā)高血糖[1]。T1DM需終身使用外源性胰島素，如治療不及時或治療不當會引起嚴重并發(fā)癥，影響患者生活質(zhì)量，甚至危及生命。目前臨床上使用的胰島素可有效降低血糖，從一定程度上減緩糖尿病患者并發(fā)癥的發(fā)生及進展速度，但卻無法從源頭上遏制胰島β細胞的損傷。因此，針對T1DM開發(fā)一種新的治療方式尤為重要。近年來，干細胞治療各個領域疾病的基礎和臨床研究備受關注。人臍帶來源間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)由于其再生能力強、高可塑性及低免疫原性等特點被廣泛應用于基礎和臨床探索性研究[2]。

動物和臨床探索性研究均表明，hUC-MSCs單獨或聯(lián)合其他細胞有望改善T1DM[3～6]。然而，細胞在移植受體中的分布、遷移和分化尚不完全明確。采用示蹤方法明確移植的細胞是否能歸巢到受損器官是hUC-MSCs治療T1DM發(fā)揮作用的關鍵因素之一。即往研究中，干細胞示蹤的標記方法有很多，主要包括使用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作為報告基因轉(zhuǎn)入細胞，用假核酸分子Brdu標記，生物染料PKH26、CFSE、DiL、DiR等標記，以及直接檢測受體組織中的人源基因序列的方法[4, 7～11]。其中，報告基因轉(zhuǎn)染步驟較為復雜，且熒光強度隨著細胞傳代呈遞減狀態(tài)，因此，GFP標記法存在不夠穩(wěn)定、可實施性較差的問題[12]。另一種Brdu也是較為常用的細胞標記方法。但由于已凋亡的移植細胞釋放出的Brdu可滲入周圍任何處于細胞分裂S期的細胞，因此Brdu無法判斷標記細胞是正在分裂的移植細胞還是宿主細胞[13]。

目前，在基礎研究中較為常用的標記細胞方法為直接標記移植細胞的細胞膜，但該方法在T1DM動物模型中的應用效果尚不明確[14]。本研究首次采用兩種方法，分別用親脂性細胞膜熒光染料PKH26與DiR對hUC-MSCs直接進行標記，通過構(gòu)建T1DM小鼠模型，比較尾靜脈注射PKH26標記的hUC-MSCs后組織學染色或DiR標記的hUC-MSCs后動物活體成像兩種示蹤方法的優(yōu)缺點，為探索hUC-MSCs靜脈注射后對T1DM小鼠的歸巢特征提供基礎。

材料與方法

1.材料：6～8周齡C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量為18～21g，由上海市第六人民醫(yī)院動物房提供，飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院動物房SPF環(huán)境，用于T1DM小鼠模型構(gòu)建。hUC-MSCs由上海市東方醫(yī)院干細胞基地GMP實驗室提供，原代細胞提取、傳代、鑒定方法及結(jié)果見參考文獻[15]。鏈尿佐菌素(streptozotocin, STZ)購自美國Sigma-Aldrich公司，MEM Alpha培養(yǎng)基、胎牛血清FBS購自美國Gibco公司，細胞膜染料PKH26購自美國Sigma-Aldrich公司，細胞膜染料DiR購自美國Thermo Fisher公司。

2.動物分組及T1DM模型構(gòu)建：T1DM小鼠模型的構(gòu)建方法為C57BL/6J小鼠單次腹腔注射STZ溶液(50mg/kg)，1周后測定隨機血糖>16.7mmol/L認為T1DM小鼠模型造模成功，未注射STZ的C57BL/6J小鼠作為正常對照。構(gòu)建成功的T1DM模型小鼠分為4組，分別是PKH26標記細胞注射組(PKH26+組)及空白對照組(對照組1)，DiR標記細胞注射組(DiR+組)及空白對照組(對照組2)，每組小鼠數(shù)量為3只。

3.PKH26標記hUC-MSCs：取第4代hUC-MSCs，將用胰蛋白酶消化后的細胞置于離心管中，1500r/min離心5min后棄上清，再用PBS清洗1次，重懸于稀釋液C內(nèi)(細胞濃度約為2×107/ml)。避光環(huán)境下，將以上細胞懸液迅速加入PKH26稀釋液中，反復吹打混勻，于室溫避光孵育3min，每隔1min顛倒混勻1次。隨后加入1ml血清終止染色。1500r/min離心5min后棄上清，用含血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，最后用PBS重懸細胞，用于尾靜脈注射。

4.DiR標記hUC-MSCs：取第4代hUC-MSCs，將用胰蛋白酶消化后的細胞置于離心管中，1500r/min離心5min后棄上清，重懸于PBS內(nèi)[細胞濃度約為(3～5)×106/ml]。避光環(huán)境下，向每毫升細胞懸液中加入1μl濃度為10mmol/L的DiR稀釋液，反復吹打混勻，置于細胞培養(yǎng)箱中染色30min。加入PBS沖洗細胞懸液，1500r/min離心5min，再用PBS洗滌細胞2次，最后用PBS重懸細胞，用于尾靜脈注射。

5.細胞移植：將PKH26或DiR標記的hUC-MSCs經(jīng)尾靜脈移植入T1DM小鼠，每只小鼠注射的細胞量為1×106，對照組1及對照組2均注射等體積的PBS，每組各3只，于移植后24h取材或進行活體成像。

6.觀察PKH26標記的hUC-MSCs在T1DM小鼠組織中的歸巢：hUC-MSCs移植24h后麻醉小鼠，通過左心室用0.9%氯化鈉溶液進行灌注，取胰腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等6種組織用OCT進行包埋。用冷凍切片機進行常規(guī)切片，切片厚度約6～10μm。隨后用細胞核染料DAPI染細胞核，室溫孵育7min，用PBS洗滌3次，每次5min。最后用50%甘油PBS封片后在熒光顯微鏡下觀察。

7.活體觀察DiR標記的hUC-MSCs在T1DM小鼠臟器內(nèi)的歸巢：hUC-MSCs移植24h后麻醉小鼠，采用活體成像系統(tǒng)檢測熒光信號強度，同時用PBS注射作為對照組2去除生物發(fā)光背景?；铙w成像結(jié)束后，將小鼠過量麻醉致死，取胰腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等6種臟器分別在活體成像系統(tǒng)中成像，觀察hUC-MSCs在不同器官中歸巢情況。

結(jié) 果

1.體外PKH26標記hUC-MSCs的效果觀察：熒光倒置顯微鏡下觀察，hUC-MSCs細胞懸液經(jīng)PKH26標記后，可見整個細胞均呈現(xiàn)紅色，染色效率約為100%(圖1)。

圖1 PKH26染色效率A.hUC-MSCs光學顯微鏡照片；B.同一視野下PKH26染色后熒光效果(×200)

2.體外DiR標記hUC-MSCs的效果觀察：細胞懸液經(jīng)DiR染色，經(jīng)活體成像系統(tǒng)成像后發(fā)光強度為2.5×1010p/s，顯著高于未染色hUC-MSCs細胞(圖2)。

圖2 活體成像系統(tǒng)下DiR體外熒光強度檢測A.未染色hUC-MSCs成像；B.DiR染色hUC-MSCs成像

3.T1DM小鼠模型鑒定：STZ注射后6天，T1DM小鼠模型隨機血糖升至16.31±2.44mmol/L(圖3)，12天后上升至25mmol/L左右，而正常對照小鼠隨機血糖維持在8mmol/L左右，T1DM小鼠造模成功。

圖3 T1DM小鼠模型鑒定與正常對照比較，*P<0.01

4.PKH26標記的hUC-MSCs在T1DM小鼠體內(nèi)示蹤效果：PKH26標記的hUC-MSCs尾靜脈移植入T1DM小鼠體內(nèi)后24h，取PKH26+組T1DM小鼠胰腺、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等6種組織制作冷凍切片在熒光倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)在以上器官中均可找到紅色熒光標記的細胞，熒光強度較為明顯，但細胞形態(tài)不規(guī)則(圖4A)。其中，熒光信號表達量最高的器官為脾臟組織，其次為肝臟和肺組織，在胰腺組織中也可觀察到發(fā)射紅色熒光的hUC-MSCs，歸巢效果最不明顯的為心肌組織(圖4B)。

圖4 PKH26標記hUC-MSCs在T1DM小鼠體內(nèi)示蹤A.熒光顯微鏡下各組織中hUC-MSCs歸巢情況(×200);B.熒光量化結(jié)果。箭頭所示為組織冷凍切片中PKH26染色陽性的細胞

5.DiR標記的hUC-MSCs在T1DM小鼠體內(nèi)示蹤效果：動物活體成像結(jié)果顯示，DiR+組在hUC-MSCs移植24h后即可在體內(nèi)檢測到hUC-MSCs發(fā)射的熒光信號，經(jīng)量化后與對照組2比較，差異有統(tǒng)計學意義 [(2.21±0.07)×109p/s vs (7.80±0.60)×109p/s，P=0.000]， 且主要集中在胸腹腔臟器分布部位，判斷結(jié)果為陽性。分析小鼠各臟器熒光表達量，結(jié)果表明，在所進行熒光檢測的6種臟器中，肝臟平均熒光表達量最高，為(378.13±10.00)×108p/s。肺次之，平均熒光表達量為(81.98±2.44)×108p/s。心臟中檢測到的平均熒光表達量最低，為7.8×107p/s。在T1DM小鼠胰腺中也檢測到陽性熒光信號，平均表達量為(1.14±0.11)×108p/s。各組織平均熒光表達量詳見圖5。

圖5 DiR標記hUC-MSCs在T1DM小鼠體內(nèi)示蹤A.T1DM小鼠活體動物成像；B.活體成像量化結(jié)果；C.T1DM小鼠臟器成像；D.臟器成像量化結(jié)果

討 論

運用模型動物可模擬人體糖尿病狀態(tài)下的疾病特征，為研究hUC-MSCs在T1DM患者體內(nèi)的歸巢提供參考。hUC-MSCs作為間充質(zhì)干細胞的重要來源之一，在糖尿病治療領域已取得一定進展。其發(fā)揮作用的機制包括調(diào)節(jié)免疫、分泌各種細胞因子等[2]。干細胞在動物體內(nèi)的歸巢程度對于明確hUC-MSCs治療T1DM的機制研究具有重要意義。Maldonado等[4]用DiL標記hUC-MSCs后腹腔注射入T1DM小鼠體內(nèi)，解剖后可在小鼠腹腔觀察到呈紅染的胰腺。同時，實時熒光定量PCR檢測小鼠各部分臟器中人源DNA序列的表達量，可在小鼠肝臟、腎臟、胰腺、脾臟組織中檢測到人源DNA的表達，提示在T1DM小鼠的胰腺中存在歸巢的hUC-MSCs。然而，DiL標記實驗中肉眼觀察到的呈紅染的胰腺組織不能排除是由于移植細胞所攜帶的熒光染料轉(zhuǎn)移至胰腺所造成的假陽性結(jié)果。另一方面，人源DNA的定量檢測結(jié)果雖相對可靠，但缺乏直觀的影像觀察結(jié)果。DiR作為一種發(fā)近紅外熒光親脂性細胞膜染料(與DiO、DiD、DiL屬于同一家族)，在嵌入細胞膜后會發(fā)出明亮且穩(wěn)定的熒光，這類染料有很高的激發(fā)態(tài)壽命和淬滅常數(shù)，染色效率極高，且對細胞生物特性及生理狀態(tài)無明顯影響。相較于其他細胞標記方式，DiR的發(fā)射波長約為780nm，組織穿透力更強，其發(fā)射光基本不受機體自身組織背景的干擾，是用于動物活體成像的理想材料[14, 16, 17]。另一方面，PKH26的發(fā)射波長為576nm，與DiR比較，更適合于熒光顯微鏡下觀察。

由于臨床上進行干細胞移植多采用靜脈注射[18, 19]。因此，本研究選用尾靜脈注射方式作為hUC-MSCs動物示蹤的研究方法。本研究首次應用PKH26與DiR兩種標記細胞方式，對hUC-MSCs在T1DM小鼠模型中進行示蹤，獲得較好的成像效果。一方面，移植后24h，可在熒光顯微鏡下觀察到胰腺組織冷凍切片中PKH26標記的細胞，證實了尾靜脈注射的hUC-MSCs可歸巢至STZ誘導的T1DM小鼠胰腺，同時也證實了hUC-MSCs在高血糖微環(huán)境中的趨化能力，與Yin等[20]報道的結(jié)果一致。在肝臟、脾臟、肺、腎臟、心臟等組織中均可觀察到PKH26陽性細胞。量化結(jié)果顯示，脾臟組織切片中PKH26陽性表達的細胞最多，其次為肝臟、肺等血管豐富的器官。胰腺組織中觀察到的hUC-MSCs高與心臟和腎臟組織。另一方面，采用DiR標記的細胞對T1DM小鼠進行活體成像，結(jié)果顯示在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胰腺中均可檢測到陽性熒光信號。胰腺組織中也可觀察到陽性熒光信號，且熒光信號高與心臟和腎臟組織。與PKH26標記細胞示蹤結(jié)果不同的是，DiR標記的成像結(jié)果中可在肝臟中觀察到較強的熒光信號，這可能與肝臟血供較為充沛且臟器體積較大有關。

當然，PKH26與DiR標記方法也存在一定的不足，有報道稱細胞膜親脂染料可能存在染料轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，即移植入體內(nèi)的細胞凋亡破碎后，其細胞碎片可能會被臨近巨噬細胞吞噬，細胞膜上的染料隨之轉(zhuǎn)移至這些細胞膜上。同時，細胞膜染料的局限性還在于不能區(qū)分觀察到的陽性信號是存活細胞還是凋亡細胞，在體內(nèi)示蹤檢測移植細胞的存活狀態(tài)方面沒有報告基因標記有優(yōu)勢。因此，有待于開發(fā)一種能在活體中穩(wěn)定表達，且能特異性標記移植的存活細胞的示蹤方法。

本研究表明，采用PKH26或DiR標記hUC-MSCs可觀察到T1DM小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胰腺中移植細胞的歸巢情況，并對實驗結(jié)果進行量化。其中，PKH26標記適用于熒光顯微鏡下觀察對組織切片中的hUC-MSCs移植細胞進行量化。DiR標記適用于在活體成像系統(tǒng)中觀察hUC-MSCs移植細胞在活體動物組織中的分布，并進行離體組織量化。本研究為hUC-MSCs治療T1DM的機制研究奠定基礎。