王純?nèi)A 郭秋霞 謝漢彬

廣東省汕頭市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東汕頭 515000

結(jié)核病是危害我國(guó)公共衛(wèi)生健康安全的重要疾病之一，盡早診斷結(jié)核病對(duì)于預(yù)防該病的傳播具有重要意義[1]。目前臨床診斷結(jié)核病的方法仍舊是采取實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的方式，但是這種方式的耗時(shí)長(zhǎng)，檢驗(yàn)效率低下，無(wú)法進(jìn)行大數(shù)據(jù)篩查[2]。熒光定量PCR方法是一種高效且靈敏度、特異度較高的檢驗(yàn)方法，能夠有效鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的實(shí)際狀態(tài)，從而指導(dǎo)臨床診斷與治療，做出更加科學(xué)的決策[3]。為了進(jìn)一步分析熒光定量PCR方法的應(yīng)用價(jià)值，本研究選取2019年6月至2020年6月醫(yī)院接收436例結(jié)核可疑患者共計(jì)470份臨床樣本進(jìn)行對(duì)照觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月至2020年6月醫(yī)院接收436例結(jié)核可疑患者，其中男225例，女211例；年齡19～68歲，平均（41.0±8.6）歲，共計(jì)470份臨床樣本（其中414份為肺內(nèi)樣本，56份為肺外樣本），本研究樣本中肺內(nèi)樣本主要為痰液樣本，肺外樣本包括了胸腔積液、淋巴結(jié)液、尿液、膿液等樣本。入選患者均對(duì)本研究知情并簽署同意。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 將痰，胸腔積液、淋巴結(jié)液、尿液、膿液等樣本進(jìn)行前處理后放入改良羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 熒光定量PCR法檢測(cè)方法 將痰液化后和胸腔積液、淋巴結(jié)液、尿液、膿液等樣本離心，取沉淀進(jìn)行滅活，結(jié)束后至室溫離心然后將樣本加入結(jié)核桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑增強(qiáng)液到Lab Aid 824提取儀提取核酸。將待測(cè)樣本及陰陽(yáng)對(duì)照品加入TB-DNA提取液分裝至8聯(lián)管孔上SLAN-96SPCR擴(kuò)增。儀器PCR反應(yīng)程序：先使用50℃ UNG處理，持續(xù)時(shí)間為2 min，之后使用95℃ UNG酶失活，預(yù)變性10 min，之后Touchdown循環(huán)程序10個(gè)，PCR循環(huán)程序45個(gè)，之后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CT值。本研究采用SLAN-96S核酸擴(kuò)增儀、BD BACTEC MGMT960結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)儀、培養(yǎng)管批號(hào)：國(guó)械準(zhǔn)進(jìn)20142405711，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢驗(yàn)劑批號(hào)為：20112601。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，分析熒光定量PCR法的檢驗(yàn)結(jié)果，并觀察熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的靈敏度與特異度。靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR法肺內(nèi)樣本檢測(cè)結(jié)果

在414份肺內(nèi)樣本中，培養(yǎng)陽(yáng)性共計(jì)60份，培養(yǎng)陰性共計(jì)354份，熒光定量PCR檢測(cè)中靈敏度為97.8%，特異度為97.5%，見表1。

表1 熒光定量PCR法肺內(nèi)樣本檢測(cè)結(jié)果

2.2 熒光定量PCR法肺外樣本檢測(cè)結(jié)果

在56份肺外樣本中，培養(yǎng)陽(yáng)性共計(jì)12份，培養(yǎng)陰性共計(jì)44份，熒光定量PCR檢測(cè)中靈敏度為100.0%，特異度為94.4%，見表2。

表2 熒光定量PCR法肺外樣本檢測(cè)結(jié)果

2.3 熒光定量PCR法總樣本檢測(cè)結(jié)果

本研究結(jié)果顯示，熒光定量PCR檢測(cè)中靈敏度為98.2%，特異度為97.2%，見表3。

表3 熒光定量PCR法總樣本檢測(cè)結(jié)果

3 討論

結(jié)核病是一種傳染性疾病，自抗結(jié)核病治療方案應(yīng)用以來(lái)，耐藥以及耐多藥結(jié)核病的發(fā)生率不斷升高，同時(shí)存在HIV以及結(jié)核分枝桿菌雙重感染的風(fēng)險(xiǎn)，加上全球人口流動(dòng)性的提高使得結(jié)核病的發(fā)生率有所升高，即使是歐美國(guó)家也有出現(xiàn)反彈的情況[4]。根據(jù)世界衛(wèi)生報(bào)告組織調(diào)查顯示，世界有超過1/3的人感染了結(jié)核桿菌，也就是有超過20億人感染結(jié)核桿菌，而活動(dòng)性肺結(jié)核患者數(shù)量超過2000萬(wàn)，每年新增結(jié)核病患者超過300萬(wàn)，我國(guó)是結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，活動(dòng)性肺結(jié)核患者數(shù)量位居全球第二，根據(jù)我國(guó)流行病調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)活動(dòng)性肺結(jié)核患者超過600萬(wàn)，且傳染性肺結(jié)核患者超過200萬(wàn)[5]。因此防治結(jié)核病是我國(guó)臨床醫(yī)學(xué)研究的重要課題。

結(jié)核分枝桿菌在干痰中存活6～8個(gè)月，如粘附在塵埃上傳染性可保持8～10 d，在酸性溶液中能夠存活30 min，但是對(duì)紫外線以及酒精的抵抗力弱，太陽(yáng)直射2～3 h失活，75%乙醇接觸后數(shù)分鐘內(nèi)死亡[6]。近年來(lái)隨著該病發(fā)生率的升高，發(fā)現(xiàn)耐藥性與耐多藥結(jié)核分枝桿菌不斷增多，甚至出現(xiàn)流行的趨勢(shì)[7]。耐藥結(jié)核桿菌感染使得臨床治療越來(lái)越復(fù)雜，尤其是對(duì)異煙肼、利福平耐藥的患者。

結(jié)核桿菌感染可分為原發(fā)性感染與繼發(fā)性感染[8]。原發(fā)性結(jié)核桿菌感染常見于兒童、老年人以及免疫力低下人群，主要是由于結(jié)核桿菌隨著飛沫以及灰塵進(jìn)入肺泡，而巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌之后由于吞噬體與細(xì)胞壁上的碳酸腦苷脂結(jié)合從而無(wú)法起到殺菌的作用，使得結(jié)核桿菌大量生長(zhǎng)，引起炎癥病灶[9]。隨著機(jī)體免疫反應(yīng)的作用，原發(fā)病灶能夠自愈，但是其中潛伏著一些結(jié)核桿菌，在不斷免疫反應(yīng)的刺激下形成抗結(jié)核免疫力，也可以作為條件感染的病因[10]。少量免疫力極低患者可能經(jīng)淋巴、血流引起全身結(jié)核或結(jié)核性腦膜炎[11]。繼發(fā)性感染常見于成年人，主要特征為病灶局限并形成慢性肉芽腫性炎癥，形成結(jié)核結(jié)節(jié)，出現(xiàn)干酪樣壞死[12]。結(jié)核桿菌雖然具有較高的感染率，但是發(fā)病率相對(duì)較低，由此可見人體感染結(jié)核桿菌之后能夠形成一定的免疫力，且主要體現(xiàn)在細(xì)胞免疫上。

目前臨床診斷結(jié)核病主要是采取實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，但是其檢驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，容易錯(cuò)過疾病治療的最佳時(shí)間，并且可能造成該病的傳播。因此為了盡可能提高結(jié)核病的臨床診斷結(jié)果，需要采取更加有效的檢驗(yàn)方法[13]。熒光定量PCR方法是臨床檢驗(yàn)的常用方法，主要采取決定定量和相對(duì)定量，前者主要是利用已知標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣本量，而后者則主要是利用靶序列相對(duì)于另一組參照序列的變化信息計(jì)量[14]。熒光定量PCR方法目前在臨床醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用，其在HIV、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒等病原體檢測(cè)中具有較好的應(yīng)用價(jià)值[15]。

熒光定量PCR方法不僅能夠?qū)Σ≡w進(jìn)行定性定量分析，同時(shí)由于差異小、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，能夠定量病原體DNA、RNA，最主要的是能夠?qū)Σ≡w復(fù)制與活動(dòng)情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，從而為疾病檢查確定觀察，例如抗病毒治療效果、藥敏測(cè)試等。熒光定量PCR方法在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)與結(jié)核桿菌核算量與該病的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后之間有密切的相關(guān)性，且樣本中細(xì)胞因子含量低的情況下也有著較高的敏感性與準(zhǔn)確性，因此對(duì)于該病的臨床診斷與治療評(píng)估有著較好的應(yīng)用價(jià)值。本研究中414份肺內(nèi)樣本中，培養(yǎng)陽(yáng)性共計(jì)60份，培養(yǎng)陰性共計(jì)354份，熒光定量PCR檢測(cè)中靈敏度為97.8%，特異度為97.5%；在56份肺外樣本中，培養(yǎng)陽(yáng)性共計(jì)12份，培養(yǎng)陰性共計(jì)44份，熒光定量PCR檢測(cè)中靈敏度為100.0%，特異度為94.4%。以本研究總樣本的培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，熒光定量PCR檢測(cè)中靈敏度為98.2%，特異度為97.2%，由此可見熒光定量PCR方法具有較好的應(yīng)用效果，能夠有效提高結(jié)核病的臨床診斷準(zhǔn)確率，有助于患者盡早進(jìn)行治療，從而改善患者的預(yù)后情況。

綜上所述，熒光定量PCR方法在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群臨床檢驗(yàn)中具有較高的靈敏度與特異度，值得推廣應(yīng)用。