王慶鵬 陳曉英 駱獻(xiàn)麗 李 原 劉山崎 張明輝

樂普藥業(yè)股份有限公司，河南鄭州 450000

替格瑞洛主要用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征（包括不穩(wěn)定性心絞痛、非ST段抬高心肌梗死或ST段抬高心肌梗死）患者，包括接收藥物治療和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）治療的患者，降低血栓性心血管事件的發(fā)生率[1]。替格瑞洛的工藝雜質(zhì)N，N-二乙基苯胺，被視為遺傳毒性雜質(zhì)[2-3]。遺傳毒性雜質(zhì)是指能引起DNA損傷，導(dǎo)致DNA突變的雜質(zhì)，嚴(yán)重威脅人類健康，已被廣泛關(guān)注及嚴(yán)控。主要來源于原料藥或制劑的生產(chǎn)過程，如起始原料、反應(yīng)物、催化劑、試劑、溶劑、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等。根據(jù)歐洲EMEA、美國FDA和國際藥品注冊(cè)協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）及中華人民共和國藥典（四部）關(guān)于基因毒性雜質(zhì)的指導(dǎo)原則等要求[4-5]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[6-15]具有靈敏度高、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，可以滿足痕量毒性雜質(zhì)檢測(cè)的要求。本研究建立了LC-MS/MS法，可準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定替格瑞洛原料藥中基因毒性雜質(zhì)N，N-二乙基苯胺的含量。

1 儀器與試劑

AB SCIEX ExionLC-QTRAP5500高效液相色譜儀-三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；色譜柱為苯基柱（Ultimate?UHPLC XB-Phenyl，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；MS205DU型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

甲 醇（LC/MS級(jí) 別，F(xiàn)isher），乙 腈（LC/MS級(jí)別，F(xiàn)isher），甲酸（HPLC級(jí)別，Dikmapure），水（蒸餾水，屈臣氏）；對(duì)照品：N，N-二乙基苯胺（批號(hào)：20170426，純度：99.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；替格瑞洛原料藥（批號(hào)：Q19010701G、Q19010702G、Q19010703G，浙江樂普藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法條件

2.1.1 色譜條件 液相色譜柱：Ultimate?UHPLC XB-Phenyl（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流 速0.3 ml/min；以0.1% 甲酸水溶液為流動(dòng)相A，以0.1% 甲酸甲醇溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～1.5 min，5% B→ 70% B；1.5～10.0 min，70% B；10.0～10.5 min，70%B→95%B；10.5～18.0 min，95%B；18.01～22.0 min，5% B）；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：5 μl；供試品測(cè)定，于0.5 min時(shí)通過閥切換將流路切入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，于6.5 min時(shí)將流路切至廢液，避免高濃度替格瑞洛進(jìn)入質(zhì)譜儀而污染儀器。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electron sprayionization，ESI），正離子模式采集；多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction montoring，MRM），定 量 離 子 對(duì)150.2/106.0；電噴霧電壓（IS）：5500 V；渦旋離子噴霧溫度：550℃；氣簾氣（CUR）：40；碰撞池氣體：Medium；霧化氣（Gas1）：55；輔助氣（Gas2）：60；入 口 電 壓（EP）：10 V；碰 撞 室 出 口 電 壓（CXP）：13 V；碰撞能（CE）：34；去簇電壓（DP）：90 V；駐留時(shí)間：100 ms。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品貯備溶液 對(duì)照品貯備溶液Ⅰ：稱取N，N-二乙基苯胺對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇適量，使溶解，并用稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀釋制成每1 ml中約含160 ng的溶液。對(duì)照品貯備溶液Ⅱ：精密量取對(duì)照品貯備溶液Ⅰ適量，用稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀釋制成每1 ml中約含8 ng的溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密量取對(duì)照品貯備溶液Ⅰ適量，用稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀釋制成每1 ml中約含8 ng的溶液。

2.2.3 供試品溶液 取替格瑞洛約20 mg，精密稱定，置20 ml量瓶中，加入稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]適量，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取稀釋劑、對(duì)照品溶液和供試品溶液照上述條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。稀釋劑（空白溶劑）和供試品溶液不干擾N，N-二乙基苯胺的測(cè)定。

圖1 典型色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限實(shí)驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品貯備溶液Ⅰ適量，分別用稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]定量稀釋制成每1 ml中 約 含0.2、0.4、1.2、4、8、12、16 ng（2.5%～200%限度濃度）的系列濃度的線性溶液。依法測(cè)定，結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，其線性方程：y=1360 211.0060x+ 62 126.0011，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。表明N，N-二乙基苯胺在0.20～15.80 ng/ml的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

精密量取“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品貯備溶液Ⅱ適量，用稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]進(jìn)行逐級(jí)定量稀釋。當(dāng)峰高與噪音的信噪比（S/N）大于10∶1時(shí)，即定量限溶液；當(dāng)峰高與噪音的信噪比（S/N）大于3∶1時(shí)，即檢測(cè)限溶液。依法測(cè)定，結(jié)果N，N-二乙基苯胺的定量限（LOQ）為0.2 ng/ml（S/N=15.1）；檢測(cè)限（LOD）為0.06 ng/ml（S/N=4.1）。

稱取替格瑞洛樣品約20 mg，精密稱定，置20 ml量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品貯備溶液Ⅱ 0.5 ml，加入稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]適量，振搖使溶解，并用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為定量限濃度加標(biāo)供試品溶液。平行配制6份。依法測(cè)定，結(jié)果N，N-二乙基苯胺平均加樣回收率為107.5%，RSD為1.7%（n=6）。

2.3.3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 稱取替格瑞洛樣品約20 mg，精密稱定，平行9份，分別置20 ml量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)對(duì)照品貯備溶液Ⅰ各0.5、1.0、1.5 ml，每個(gè)濃度水平平行3份，加入稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]適量，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為50%、100%和150%限度濃度加標(biāo)供試品溶液。依法測(cè)定，結(jié)果見表1。平均加樣回收率為95.3%，RSD為0.84%（n=9）。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 儀器精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，依法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果N，N-二乙基苯胺峰面積的RSD為1.9%、保留時(shí)間的RSD為0.2%。

稱取替格瑞洛樣品約20 mg，精密稱定，置20 ml量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液Ⅰ 1.0 ml，加入稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]適量，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為100%限度濃度加標(biāo)供試品溶液。平行配制6份。依法測(cè)定，結(jié)果N，N-二乙基苯胺含量的RSD為0.56%。

按照“2.2.2”和“2.3.3”項(xiàng)下溶液配制方法，分別新鮮配制對(duì)照品溶液和100%限度濃度加標(biāo)供試品溶液，在室溫條件放置，于0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)，依法測(cè)定，結(jié)果對(duì)照品溶液和100%限度濃度加標(biāo)供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定（峰面積RSD＜3.0%）

2.4 樣品測(cè)定

稱取替格瑞洛（批號(hào)：Q19010701G、Q19010702G、Q19010703G）樣品各約20 mg，精密稱定，分別置20 ml量瓶中，加入稀釋劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]適量，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。依法測(cè)定，結(jié)果3批替格瑞洛中均未檢測(cè)出N，N-二乙基苯胺。

3 討論

3.1 溶劑選擇

根據(jù)替格瑞洛的溶解性和色譜條件梯度流動(dòng)相初始比例，進(jìn)行溶劑篩選。在稀釋劑篩選過程中，替格瑞洛在甲醇-水（4∶6）中未溶解；在甲醇-水（1∶1）和乙腈-水（35∶75）中均溶解，但N，N-二乙基苯胺峰分叉，經(jīng)分析存在溶劑效應(yīng)。N，N-二乙基苯胺極性強(qiáng)，易溶于水。結(jié)合色譜條件，色譜條件梯度初始比例甲醇-水（5∶95），當(dāng)溶劑中甲醇比例高時(shí)，存在溶劑效應(yīng)，故須降低溶劑中甲醇比例。N，N-二乙基苯胺峰處流動(dòng)相有機(jī)相甲醇比例約占70%和替格瑞洛在低比例乙腈溶劑中易溶的特性，優(yōu)先采用甲醇-乙腈-水的混合溶劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]，結(jié)果N，N-二乙基苯胺峰型良好，無溶劑效應(yīng)。

3.2 色譜條件選擇

根據(jù)N，N-二乙基苯胺的一級(jí)質(zhì)譜掃描所得母離子（Q1）峰歸屬均為[M+H]+，要求流動(dòng)相可以提供+H的離子化環(huán)境，優(yōu)先考慮揮發(fā)性酸和甲醇，結(jié)果以0.1%的甲酸水溶液和0.1%甲酸的甲醇溶液為流動(dòng)相，為其提供穩(wěn)定離子化環(huán)境。由于N，N-二乙基苯胺具有易隨水蒸氣揮發(fā)的特性，在溶劑[甲醇-乙腈-水（1∶1∶2）]中易揮發(fā)。溶液制備和進(jìn)樣過程中，避免因揮發(fā)導(dǎo)致交叉污染。自動(dòng)進(jìn)樣器控溫4℃和樣品進(jìn)樣前保持密封，可有效降低交叉污染。

3.3 質(zhì)譜條件選擇

在本方法條件下，替格瑞洛出峰位置在6.8 min處，由于其樣品濃度較高，于0.5 min時(shí)通過閥切換將流路切入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，于6.5 min時(shí)將流路切至廢液，避免高濃度替格瑞洛進(jìn)入質(zhì)譜儀污染儀器。通過一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜掃描確定了定量離子對(duì)（Q1/Q3）150.2/106.0。在MRM模式下，優(yōu)化得到碰撞能為34和去簇電壓為90 V。改善霧化效果，提高氣簾氣為40、霧化氣為55和輔助氣60，其它質(zhì)譜參數(shù)均采用儀器推薦值。N，N－二乙基芳香胺類化合物中的氮原子含有孤對(duì)電子，容易締合質(zhì)子，形成穩(wěn)定的質(zhì)子化離子[M+H]+，在一級(jí)質(zhì)譜圖中可檢測(cè)到基峰N，N-二乙基苯胺質(zhì)子化分子離子m/z 150.2，見圖2。在二級(jí)質(zhì)譜圖中可檢測(cè)到子離子m/z 106.0，見圖3。推斷碎裂過程：母離子m/z 150.2發(fā)生裂解形成離子中性復(fù)合物后，繼續(xù)發(fā)生氫遷移和單電子轉(zhuǎn)移，形成離子m/z 121.1，并在自由基驅(qū)動(dòng)下發(fā)生α斷裂丟失甲基自由基產(chǎn)生子離子m/z 106.0，見圖4[16]。

圖2 N，N-二乙基苯胺的一級(jí)質(zhì)譜圖

圖3 N，N-二乙基苯胺的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖4 質(zhì)子化N，N-二乙基苯胺的碎裂過程

本研究建立了采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定替格瑞洛原料藥中N，N-二乙基苯胺含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證及樣品檢測(cè)，結(jié)果在3批樣品中均未檢出N，N-二乙基苯胺。根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）發(fā)布基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 μg/d[4]。結(jié)合替格瑞洛片說明書[1]最大日劑量180 mg，計(jì)算其限度為8.3 ppm，并按照限度為8 ppm進(jìn)行控制。該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，滿足基因毒性雜質(zhì)測(cè)定要求，可準(zhǔn)確地測(cè)定替格瑞洛原料藥中N，N-二乙基苯胺，以有效控制原料藥的質(zhì)量。