朱四紅 譚布珍 胡 輝 陳庚發(fā)

卵巢癌是全球女性癌癥死亡原因的第5位[1]，其預后與基礎病變、轉移途徑和化療的耐藥性密切相關。目前卵巢癌的標準治療是腫瘤減滅術和以鉑類藥物為基礎的化療方案，但卵巢癌耐藥問題日趨嚴重，患者多因耐藥而導致治療失敗和腫瘤復發(fā)[2-3]。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TP)是從雷公藤中分離到的二萜內(nèi)酯化合物，具有多效抗癌活性。已有大量實驗研究證實，雷公藤內(nèi)酯醇對各種癌癥細胞及動物模型具有一定的抗癌作用[4-6]，其機制主要與抑制腫瘤細胞的增殖和誘導多種腫瘤的凋亡有關。

本課題組前期通過一系列體內(nèi)外實驗觀察了雷公藤內(nèi)酯醇對卵巢癌細胞具有明顯的殺傷和促凋亡作用，其機制可能與上調(diào)Caspase-3和Caspase-7的表達、下調(diào)PIK3、p-Akt、p-GSK3β、MMP2、Sorcin、VEGF的表達，阻滯細胞周期、抑制PIK3/AKT/GSK3β信號通路和NF-kB轉錄等有關。本課題擬進一步探索雷公藤內(nèi)酯醇是否通過抑制HIF-1α信號通路，進而導致MMP2、Sorcin、VEGF表達下降，促進細胞凋亡，并逆轉卵巢癌細胞耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料

雷公藤內(nèi)酯醇購自Solarbio公司；SKOV3和SKOV3/DDP細胞購自中國科學院上海細胞庫；一抗鼠源GAPDH抗體購自proteintech公司；一抗兔抗Scorin、MMP2和VEGF蛋白單克隆抗體購自Abcam公司；二抗山羊抗兔和山羊抗鼠、普通敏化學發(fā)光試劑盒購自北京全式金公司；TUNEL檢測試劑盒、RIPA裂解液(強)購自碧云天公司；Western及IP裂解液購自北京普利萊公司；胰蛋白酶、Tween20購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自HyClone公司；超敏化學發(fā)光試劑盒、蛋白Marker、Western膜再生液購自美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 Western blot實驗檢測雷公藤內(nèi)酯醇對HIF-1α蛋白的影響 實驗分為2組：SKOV3/DDP細胞組和SKOV3/DDP細胞+TP組。在2組樣本加入相應的裂解液中，4 ℃裂解30 min，在10 000 rpm/min離心10 min，小心吸取上清液，即得總蛋白。利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。蛋白變性、上樣、電泳1～2 h，濕法轉膜30～50 min。4 ℃孵育一抗溶液過夜；室溫孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.2.2 SKOV3/DDP細胞轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒 實驗分為2組：SKOV3/DDP細胞組(NC)和轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒后的SKOV3/DDP細胞組(shHIF-1α)。將對數(shù)生長期的SKOV3/DDP細胞，接種于6孔板；孵育48 h；將脂質(zhì)體、質(zhì)粒置于室溫，用前混勻；用Opti-MEM將4 μg質(zhì)粒DNA稀釋成250 μl，輕輕混勻；用250 μl Opti-MEM將脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 10 μl稀釋，孵育5 min；將稀釋的質(zhì)粒DNA和稀釋的脂質(zhì)體混合，孵育25 min；每孔加入質(zhì)粒DNA脂質(zhì)體復合物500 μl，孵育至相應時間，進行相應的檢測，每一項實驗均重復3次；6 h后，更換完全培養(yǎng)基，中止轉染。48 h后，在熒光顯微鏡下觀察SKOV3/DDP細胞轉染情況。

1.2.3 Western blot檢測細胞轉染后HIF-1α、MMP2、Sorcin、VEGF的表達 實驗分組同1.2.2。實驗方法同1.2.1。

1.2.4 TUNEL觀察細胞凋亡情況 實驗分組同1.2.2。制片后將組織切片入放入65 °C烤箱中烤2 h；切片在二甲苯放置10 min，更換二甲苯再放置10 min；將切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和純化水中各5 min。將切片移入濕盒中，每個樣本上滴加 50 μg/ml Proteinase K工作液，37℃反應 30 min。PBS充分洗滌3次，每次5 min。用吸水紙吸掉組織周圍的PBS，每張玻片滴加足夠量的TUNEL檢測液，45 °C避光孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min；用吸水紙吸干玻片上的液體，用抗熒光淬滅封片后，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 25.0軟件分析，計量資料采用t檢驗。若P<0.05，則認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western blot檢測雷公藤內(nèi)酯醇對HIF-1α蛋白的影響

Western bolt檢測2組細胞中HIF-1α的表達情況，結果示：SKOV3/DDP組中HIF-1α蛋白灰度值為1.057±0.008，SKOV3/DDP+TP組中HIF-1α蛋白灰度值為0.357±0.031。由此可見，與SKOV3/DDP組細胞相比，SKOV3/DDP+TP組的HIF-1α表達明顯降低(t=37.96，P<0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測各組HIF-1α的表達情況

2.2 熒光顯微鏡觀察SKOV3/DDP細胞轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒

SKOV3/DDP細胞轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒48 h后，在熒光倒置顯微鏡下用藍光激發(fā)，激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為520 nm，可見細胞中出現(xiàn)綠色熒光，表明SKOV3/DDP細胞轉染成功，并且能夠正常表達其功能(如圖2箭頭所示所示)。

圖2 熒光顯微鏡下觀察SKOV3/DDP細胞轉染后的熒光反應

2.3 Western blot檢測轉染后HIF-1α的表達情況

在SKOV3/DDP細胞轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒后，Western blot檢測2組HIF-1α的表達情況，結果示：SKOV3/DDP(NC)組中HIF-1α蛋白灰度值為1.063±0.161；轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒后的SKOV3/DDP細胞(shHIF-1α)組中HIF-1α蛋白灰度值為0.223±0.106。由此可見，轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒后的SKOV3/DDP細胞的HIF-1α蛋白表達水平顯著下降，與對空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.53，P<0.05)，見圖3。

圖3 SKOV3/DDP細胞轉染后HIF-1α的表達情況

2.4 Western blot檢測MMP2、Sorcin、VEGF的表達情況

在SKOV3/DDP細胞轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒后，SKOV3/DDP細胞的HIF-1α蛋白表達水平顯著下降。Western blot檢測2組MMP2、Sorcin、VEGF的表達情況，結果示：①NC組：MMP-2蛋白灰度值為1.032±0.153，Sorcin蛋白灰度值為1.049±0.053，VEGF蛋白灰度值為1.084±0.122。②shHIF-1α組：MMP-2蛋白灰度值為0.246±0.029，Sorcin蛋白灰度值為0.324±0.015，VEGF蛋白灰度值為0.285±0.014。由此可見，在卵巢癌SKOV3/DDP細胞轉染后，HIF-1α的表達降低后，MMP2、Sorcin、VEGF的表達均有所下降，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(如圖4及表1所示)。

圖4 2組MMP2、Sorcin、VEGF的表達情況

表1 2組間MMP-2、Sorcin、VEGF 蛋白灰度值的比較

2.5 TUNEL觀察轉染后細胞凋亡情況

TUNEL觀察轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒后SKOV3/DDP細胞凋亡情況結果示：SKOV3/DDP組：每個視野細胞凋亡數(shù)目為7.33±2.08；SKOV3/DDP+TP組：每個細胞凋亡數(shù)目為31.33±3.06。由此可見，在卵巢癌SKOV3/DDP細胞轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒后，降低HIF-1α的表達后，凋亡細胞數(shù)目明顯增加，差別有統(tǒng)計學意義(t=11.23，P<0.05)，如圖5。

圖5 TUNEL檢測轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒后細胞凋亡情況

3 討論

腫瘤微環(huán)境的特點為組織缺氧、酸中毒、間質(zhì)高壓、大量生長因子和蛋白水解酶產(chǎn)生及免疫炎性反應等，其中最典型的就是缺氧和酸中毒[7-8]。腫瘤細胞需要上調(diào)缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)，激活細胞增殖，促進血管新生和下調(diào)細胞凋亡水平，使其在缺氧條件下能繼續(xù)存活并增殖[9-11]。

HIF1-α是介導細胞低氧反應的關鍵核轉錄因子，參與腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的調(diào)控，對卵巢癌多藥耐藥的形成起到多方面作用[12-13]。HIF-1α在多種惡性腫瘤中過表達，如卵巢癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌等，作為腫瘤組織低氧性適應中的關鍵因子，其已成為惡性腫瘤治療研究的重要靶點之一[14-15]。多項實驗研究證實低氧環(huán)境所誘導的HIF-1與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展關系密切，其機制可能與促進MMP2、Sorcin、VEGF表達增高有關[16-18]。監(jiān)測腫瘤組織中HIF1-a和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達率，能輔助早期診斷卵巢癌并預測其侵襲性[19]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是一類參與多種組織細胞外基質(zhì)降解的蛋白酶家族，其中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2在腫瘤的血管化、腫瘤細胞的侵襲和轉移的形成中均起著重要作用?？扇苄阅退幭嚓P鈣結合蛋白基因(Soluble resistance-associated calcium-blinding protein，Sorcin)是一種可溶性耐藥相關鈣結合蛋白，與癌細胞的多藥耐藥有關。HIF-1還可介導內(nèi)皮素-1、P-gp上調(diào)而促進卵巢癌細胞播散和侵襲[20-22]。研究[23-25]發(fā)現(xiàn)沉默或下調(diào)人卵巢癌細胞的HIF-1α表達后，能抑制卵巢癌多藥耐藥，并可增加其對順鉑的敏感性。

本實驗中，SKOV3/DDP+TP組的HIF-1α表達明顯降低，SKOV3/DDP細胞轉染HIF-1α干擾質(zhì)粒，降低了HIF-1α的表達，且MMP2、Sorcin、VEGF的表達均有所下降，且細胞凋亡數(shù)目顯著增加。由此推測，雷公藤內(nèi)酯醇可降低HIF-1α的表達，并通過抑制HIF-1α信號通路，進而導致MMP2、Sorcin、VEGF蛋白的表達下降，促進細胞凋亡，從而逆轉卵巢癌細胞的耐藥性，增加其對順鉑的敏感性。本研究將為雷公藤內(nèi)酯醇成為新的化療藥物，或作為化療增敏劑與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應用治療難治性或耐藥性卵巢癌提供重要的實驗依據(jù)。