范瑞娟 王 瑾 郭醒爽 楊 敏

近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出加速增長的趨勢，臨床預(yù)后較差，5年總生存率低于15%[1]。肺癌的臨床治療仍以化療為基礎(chǔ)，但化療藥物的副作用限制了其臨床應(yīng)用。中西醫(yī)結(jié)合可以達(dá)到降低毒性，提高效率的目的[2]。近年來，臨床腫瘤的治療越來越受到關(guān)注，特別是在改善癥狀，提高生活質(zhì)量方面。欖香烯是從姜科溫莪術(shù)揮發(fā)油中提取的抗癌活性成分，主要活性成分是β-欖香烯，其在臨床使用中乳化以獲得欖香烯乳劑注射劑[3]。欖香烯的抗癌生物活性主要是抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂過程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長，并且具有較輕微的不良反應(yīng)[4]。本次研究選取近交系C57BL/6小鼠40只，探討欖香烯乳聯(lián)合化療對Lewis肺癌的影響及機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

選取近交系C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，人工光照明暗各12 h，溫度20 ℃～24 ℃，濕度50%～60%，自由飲水和攝食。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Lewis肺癌小鼠模型建立 將Lewis肺癌細(xì)胞復(fù)蘇，并向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入100 ml/L胎牛血清用于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)傳代。在對數(shù)生長期，在無菌條件下將Lewis肺癌細(xì)胞懸浮液(2×106/ml)接種到2只C57BL小鼠的右腋皮下。接種14天后，通過脫臼處死2只C57BL荷瘤的小鼠，在無菌條件下取出腫瘤組織，根據(jù)腫瘤質(zhì)量(g)與生理鹽水(ml)1∶3的比例制備腫瘤組織勻漿。將腫瘤組織勻漿(0.2 ml/只)接種另外38只C57BL小鼠，體重16～20 g，建立Lewis肺癌小鼠模型。

1.2.2 分組及給藥 隨機(jī)分為模型組、欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組，其中欖香烯乳組腹腔注射100 mg/kg/d欖香烯乳，化療組腹腔注射3 mg/kg/d足葉乙甙和3 mg/kg/d順鉑，聯(lián)合組腹腔注射100 mg/kg/d欖香烯乳、3 mg/kg/d足葉乙甙和3 mg/kg/d順鉑，連續(xù)7 d。

1.2.3 瘤體、脾臟及胸腺測量 取出小鼠脾臟和胸腺并稱重，并計算器官指數(shù)。用游標(biāo)卡尺(精確到0.1 mm)每天在同一時間測量腫瘤最長直徑(a)和最短直徑(b)，并計算腫瘤體積(V)：V=ab2/2。

1.2.4 肺轉(zhuǎn)移灶檢測 各組小鼠肺組織用100 g/l多聚甲醛固定，解剖顯微鏡檢查肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。抑制率為(肺癌模型組中轉(zhuǎn)移的平均數(shù)-實(shí)驗(yàn)組中轉(zhuǎn)移的平均數(shù))×100%/肺癌模型組平均轉(zhuǎn)移次數(shù)。

1.2.5 血清VEGF檢測 通過人VEGF ELISA試劑盒檢測上清液中VEGF的濃度。根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行，并通過酶標(biāo)儀選擇492 nm的波長測定。

1.2.6 Western blot檢測 研磨腫瘤組織，并用組織蛋白提取試劑常規(guī)提取蛋白質(zhì)。從每組中取出4 μl蛋白質(zhì)樣品，并通過BCA方法定量蛋白質(zhì)以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品與等體積的2×SDS緩沖液混合，加熱變性，通過SDS-PAGE電泳分離上清液，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜洗滌并在5%牛血清白蛋白溶液中在室溫下封閉1 h。洗滌后，將膜置于一抗稀釋液(兔抗小鼠Per2或SIRT1一抗溶液1∶100)中，并在4 ℃溫育過夜。第2天早上洗膜后，將其轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液(堿性磷酸鹽標(biāo)記的山羊抗兔IgG溶液1∶1000)，在室溫下孵育2 h，顯影。在出現(xiàn)明顯條帶后終止反應(yīng)，最后使用GIS-2020數(shù)字圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白質(zhì)雜交條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠瘤重、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較

欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組瘤重和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均較模型組降低(P<0.05)，其中聯(lián)合組瘤重和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯低于欖香烯乳組、化療組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠瘤重、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)比較

2.2 各組小鼠免疫器官臟器指數(shù)比較

聯(lián)合組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯高于化療組和模型組(P<0.05)，但低于欖香烯乳組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠免疫器官臟器指數(shù)比較

2.3 各組小鼠血清VEGF水平比較

模型組、欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組血清VEGF分別為(112.24±15.54)pg/ml、(96.46±17.80)pg/ml、(84.03±16.61)pg/ml、(66.72±19.12)pg/ml，欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組血清VEGF均較模型組降低(P<0.05)，其中聯(lián)合組血清VEGF明顯低于欖香烯乳組、化療組(P<0.05)。

2.4 各組小鼠腫瘤組織Per2、SIRT1蛋白表達(dá)比較

聯(lián)合組腫瘤組織Per2和SIRT1蛋白相對表達(dá)量明顯高于欖香烯乳組、化療組和模型組(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組小鼠腫瘤組織Per2、SIRT1蛋白表達(dá)比較

A為模型組；B為欖香烯乳組；C為化療組；D為聯(lián)合組。

3 討論

肺癌是臨床預(yù)后不良的惡性腫瘤之一，化療在治療中占主導(dǎo)地位，但化療藥物會引起較強(qiáng)的不良反應(yīng)，其臨床應(yīng)用因此受限[1]。因此，尋找具有良好抗癌作用和小副作用的藥物是癌癥研究領(lǐng)域的重要方向。中醫(yī)藥在肺癌防治中的作用逐漸受到重視，在緩解癥狀，延長生存期，提高治療依從性，減輕和增加療效，抵抗轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)方面具有明顯的優(yōu)勢[4]。足葉乙甙是細(xì)胞周期特異性的抗腫瘤藥物，作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ靶點(diǎn)，形成穩(wěn)定的可逆復(fù)合物，可阻斷DNA修復(fù)過程，是主要的癌癥化療藥物；順鉑主要作用位點(diǎn)是DNA的嘌呤和嘧啶堿基，使癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程受到抑制，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，具有抗癌譜廣，作用強(qiáng)的特點(diǎn)，可以和與各種抗腫瘤藥物協(xié)同作用，無交叉耐藥的特點(diǎn)[5]。

由足葉乙甙和順鉑組成的EP方案是用于治療小細(xì)胞肺癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，可以有效并廣泛用于臨床實(shí)踐。然而，臨床資料顯示，足葉乙甙有更嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如嚴(yán)重的骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)和肝腎損害等；順鉑的腎毒性和胃腸道反應(yīng)也很嚴(yán)重[6]。欖香烯具有副作用小，耐受性好，可提高治療依從性，并可與化療藥物聯(lián)合使用，達(dá)到降低毒性和提高療效的效果[7]。本次研究中，各組小鼠瘤重、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)進(jìn)行比較，欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組瘤重和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均較模型組降低，其中聯(lián)合組瘤重和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯低于欖香烯乳組、化療組。說明欖香烯乳聯(lián)合足葉乙甙與順鉑化療方案可以顯著抑制肺癌小鼠腫瘤組織的生長過程，抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。各組小鼠免疫器官臟器指數(shù)比較，聯(lián)合組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯高于化療組和模型組，但低于欖香烯乳組，這表明單獨(dú)化療可導(dǎo)致肺癌小鼠脾臟和胸腺萎縮，聯(lián)合使用藥物可顯著提高肺癌小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，說明欖香烯乳可以在進(jìn)入人體后保護(hù)人體的免疫器官，增強(qiáng)機(jī)體的自身免疫功能，從而發(fā)揮其降低毒性和提高效率的抗腫瘤作用。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的生物學(xué)功能主要是刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、促進(jìn)血管生成和增加微小血管的通透性，可以為腫瘤細(xì)胞的生長和血管網(wǎng)絡(luò)的建立提供營養(yǎng)物質(zhì)[8]。VEGF在腫瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤微血管密度，惡性程度和轉(zhuǎn)移程度具有高度的正相關(guān)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[9]。VEGF與其受體結(jié)合后，促進(jìn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)血管的形成和生長，加速基底膜的降解，增強(qiáng)血管通透性，促進(jìn)肺癌的發(fā)展[10]。本次研究中，欖香烯乳組、化療組和聯(lián)合組血清VEGF均較模型組降低，其中聯(lián)合組血清VEGF明顯低于欖香烯乳組、化療組，表明欖香烯乳劑可抑制肺癌VEGF的分泌，降低血液中的濃度，減弱其對受體的影響，減緩腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，將欖香烯乳劑與化療聯(lián)合對VEGF的分泌抑制作用更強(qiáng)，表明兩者之間存在協(xié)同作用。

生物鐘是由身體自我產(chǎn)生的時間節(jié)律，不受外部因素的控制，與衰老、代謝紊亂和腫瘤形成密切相關(guān)[11]。生物體通過最近的節(jié)律調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，并且生物鐘基因的異常表達(dá)可能引起節(jié)律紊亂，導(dǎo)致腫瘤形成的風(fēng)險增加[12]。Per2基因是最近節(jié)律系統(tǒng)的重要成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和新陳代謝的多種信號通路。淋巴瘤和白血病組織中Per2蛋白的表達(dá)水平顯著低于正常組織，誘導(dǎo)Per2高表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞周期停滯，增殖能力下降和細(xì)胞凋亡加速。這些結(jié)果表明Per2基因可以抑制腫瘤生長；哺乳動物SIRT1基因是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白3脫乙酰酶，其與酵母染色質(zhì)沉默因子2最同源，并具有調(diào)節(jié)生物代謝的功能[13]。SIRT1可通過去乙酰化與Per2相互作用，在激活SIRT1后，Per2可以發(fā)生去乙?；?，并且乙?；腜er2可以通過磷酸化降解[14]。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在腫瘤形成過程中具有致癌和抑癌基因功能，其關(guān)鍵作用是維持致癌基因和抑癌基因之間的平衡[15]。

本次研究中，各組小鼠腫瘤組織Per2、SIRT1蛋白表達(dá)比較，聯(lián)合組腫瘤組織Per2和SIRT1蛋白相對表達(dá)量明顯高于欖香烯乳組、化療組和模型組。推測欖香烯乳抑制 Lewis 肺癌小鼠腫瘤生長的作用機(jī)制可能與生物鐘基因 Per2和SIRT1的表達(dá)被激活有關(guān)，且欖香烯乳聯(lián)合化療更能促進(jìn)腫瘤組織中 Per2 和 SIRT1 蛋白的表達(dá)，在臨床上治療肺癌的效果可能會更好。

綜上所述，欖香烯乳聯(lián)合化療對Lewis肺癌有較好的抑瘤作用，可能與免疫調(diào)節(jié)、VEGF下調(diào)，促進(jìn)Per2/SIRT1蛋白表達(dá)有關(guān)。