侯青霞 黃好亮 張 沛 周玉飛

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國女性生殖道惡性腫瘤中位于第二位，僅次于宮頸癌，但在北京、上海、廣州等部分地區(qū)，EC已成為女性生殖道惡性腫瘤的首位[1]。近來研究表明，EC發(fā)病率及死亡率將呈現(xiàn)上升趨勢[2]。EC患者約有5%具有遺傳易感性，在以EC為表現(xiàn)形式的遺傳綜合征中最為常見的是林奇綜合征(Lynch syndrome，LS)，故稱之為LS相關(guān)EC[3]。LS又稱為遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌綜合征(HNPCC)，是一種由MMR基因種系突變引起的常染色體顯性遺傳病。LS家族攜帶MMR種系突變基因的女性終生患EC的風(fēng)險為60%，而非LS家族的普通人群僅為2.3%[4]。目前，EC真正的發(fā)病原因目前尚不十分清楚，研究顯示約20%EC患者有家族史，表現(xiàn)出微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)，說明與MMR基因的突變有關(guān)[5]。LS患者常常會同時性或異時性地患有多種腫瘤，患結(jié)直腸癌的概率約80%，患EC的終生風(fēng)險為40%～60%。但是在女性LS患者中，EC的幾率大于或等于其發(fā)生結(jié)直腸癌的幾率，并且約50%患者是以EC為首發(fā)，因此EC可以視為LS的“前哨”腫瘤[6]。目前LS的研究集中在腸癌，對腸外腫瘤尤其是女性LS高發(fā)的EC的研究非常少，臨床缺乏對于EC高危人群的篩查指標，本研究采用多重PCR靶向富集結(jié)合新一代高通量測序技術(shù)對MMR基因進行檢測，旨在分析MMR基因在豫西地區(qū)女性中的分布頻率，評價MMR基因作為EC篩查指標的價值，深入研究MMR基因調(diào)控機制，從而為EC臨床規(guī)范化治療提供更多資料。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選擇2014年2月至2018年6月經(jīng)病理學(xué)確診為EC的86例豫西地區(qū)女性患者為研究對象。入組患者均為新發(fā)EC，年齡45～75歲。對患者的病史、家族史及臨床病理特點進行詳細采集，包括：EC發(fā)病時間、腫瘤分級和分期、發(fā)病部位、有無脈管瘤栓、發(fā)病時間間隔、有無糖尿病、高血壓及肥胖(BMI≥28)等危險因素、癌抗原CA125、一級或二級親屬中有無惡性腫瘤病史(尤其是乳腺癌、結(jié)直腸癌、女性生殖腫瘤)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者及志愿者均簽署知情同意書。

1.2 高通量測序技術(shù)檢測MMR基因

采集所有患者和健康人外周靜脈血8 ml，用DNA提取試劑盒(血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。采用電泳檢測DNA的質(zhì)量，用Qubit3.0熒光定量儀及配套的核酸定量試劑盒(Qubit dsDNA HS Assay Kits，購自Thermo Fisher Scientific)對DNA進行濃度檢測。通過多重PCR的方法，特異性的捕獲MMR基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的突變區(qū)域，PCR體系中每個樣本均有各自對應(yīng)的標簽，PCR結(jié)束即完成文庫構(gòu)建。對構(gòu)建的文庫采用磁珠法進行純化，然后用Qubit3.0熒光定量儀和配套的核酸定量試劑盒對每個文庫DNA進行濃度檢測。將多個文庫DNA按照等質(zhì)量混合制備成上機文庫原液，濃度稀釋后采用Illumina Miseq測序儀上機測序。然后通過生物信息分析判斷靶序列是否發(fā)生突變。檢測流程如圖1所示，實驗步驟嚴格按照說明書進行操作。

圖1 高通量測序技術(shù)檢測MMR基因流程

1.3 Sanger測序法驗證

采用Sanger測序法驗證新一代高通量測序的結(jié)果。選取一些在高通量測序結(jié)果中有MMR基因位點變異的代表樣本DNA，進行PCR擴增，產(chǎn)物純化后采用Sanger測序檢測。Sanger測序法采用的PCR擴增引物和測序產(chǎn)物與新一代高通量測序法所用的一致。

1.4 隨訪調(diào)查

采用門診、住院復(fù)查或電話等方式對入組患者進行隨訪。隨訪時間的間隔參考了國內(nèi)其他研究[7]。隨訪時間截止2020年12月。復(fù)發(fā)情況統(tǒng)計具體如下：對有無家族史患者的復(fù)發(fā)例數(shù)、不同病理分期患者的復(fù)發(fā)例數(shù)及復(fù)發(fā)時間進行分析統(tǒng)計，對復(fù)發(fā)患者的中位無瘤生存時間進行統(tǒng)計。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特點

入組患者年齡45～75歲，平均(58.0±6.2)歲；體重指數(shù)(BMI)16.4～27.1 kg/m2，平均(24.7±2.1)kg/m2；病理學(xué)類型子宮內(nèi)膜樣腺癌74例(高分化26例，中分化33例，低分化15例)、子宮內(nèi)膜透明細胞癌5例、癌肉瘤4例、腺鱗癌3例；手術(shù)病理分期ⅠA期36例，ⅠB期19例，Ⅱ期15例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例；發(fā)病部位子宮下段38例，非子宮下段48例；有脈管瘤栓17例，無脈管瘤栓69例；首發(fā)腫瘤出現(xiàn)后，平均第二種腫瘤發(fā)病間隔5.8年，中位發(fā)病間隔為4.9年；CA125指標水平4.20～677.3 U/ml，平均(58.6±3.8)U/ml，其中34例患者超過正常水平；11例患者有糖尿病或高血脂病史。

2.2 MMR基因突變情況

高通量測序檢測結(jié)果顯示，86例樣本中發(fā)生MMR基因突變的共有66例，總突變率為76.8%。共發(fā)現(xiàn)12種非同義單核苷酸變異(SNV)、2種同義SNV。在非同義SNV中，位于MLH1基因上的突變類型有3個：p.I219V：c.A655G、p.V384D：c.T1151A、p.Q701K：c.C2101A；位于MSH2基因上的突變類型有3個：p.L390F：c.C1168T、p.T564A：c.A1690G、p.E809K：c.G2425A；位于MSH6基因上的突變類型有2個：p.G39E：c.G116A、p.E1163V：c.A3488T；位于PMS2基因上的突變類型有4個：p.R20Q：c.G59A、p.K541E：c.A1621G、p.P470S：c.C1408T、p.T485K：c.C1454A。在同義SNV中，位于MSH6基因上的突變類型有1個：p.T1102T：c.T3306A；位于PMS2基因上的突變類型有1個：p.S260S：c.C780G。每種突變類型對應(yīng)的患者例數(shù)如表1所示。

表1 MMR基因突變情況

2.3 Sanger測序驗證結(jié)果

對MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因上不同突變位點的Sanger測序結(jié)果如圖2所示。將Sanger測序與新一代高通量測序的突變位點及堿基突變形式進行比對，結(jié)果均顯示一致。

圖2 部分樣本Sanger測序結(jié)果

2.4 復(fù)發(fā)情況

中位隨訪時間為54.0個月，隨訪期間，11例患者失訪，9(10.5%)例患者復(fù)發(fā)，其中5例在5年內(nèi)復(fù)發(fā)，中位復(fù)發(fā)時間為48.2個月，4例在5年后復(fù)發(fā)，中位復(fù)發(fā)時間為56.6個月。不同年齡段復(fù)發(fā)例數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.739)；有家族史組復(fù)發(fā)6例，無家族史組3例，有家族史組復(fù)發(fā)率明顯高于無家族史組(P=0.003)；ⅠA復(fù)發(fā)3例，ⅠB 2例，Ⅱ2例，Ⅲ1例，Ⅳ1例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.817)。中位無瘤生存時間為42.0個月，其中無家族史組、有家族史組中位無瘤生存時間分別為：(52.33±0.58)月、(36.33±1.21)月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

3 討論

近年來，隨著人們壽命的延長、長期食用激素類藥物以及肥胖等高風(fēng)險因素的增加，EC發(fā)病率趨勢逐漸上升。對于EC高危人群，除了關(guān)注患病的高危因素并改變不良生活習(xí)慣外，更重要的是要進行EC早期篩查，盡可能早期發(fā)現(xiàn)早期治療。普通女性人群患EC的概率為2.3%，而攜帶MMR突變基因的LS家族女性患EC概率高達60%，因此通過早期檢測MMR基因來篩查EC十分有意義。人類MMR基因能夠檢驗和校正復(fù)制期間發(fā)生在微衛(wèi)星樣重復(fù)DNA序列上小的插入和丟失、防止解旋的DNA序列重新結(jié)合。而MMR基因一旦發(fā)生突變，MMR蛋白的功能將受到破壞，從而引起重復(fù)DNA序列的產(chǎn)生并且DNA修復(fù)出現(xiàn)錯誤，導(dǎo)致DNA表現(xiàn)為MSI。MSI會促使癌基因激活或抑癌基因失活，最終誘發(fā)癌變[8-10]。目前MMR基因突變檢測方法主要是一代測序，對單個樣本的多個基因檢測時，需要逐一進行，這種檢測方法成本高、速度慢、通量低，不適合臨床上做大樣本篩查工作。而多重PCR靶向富集結(jié)合新一代高通量測序可以對目標基因進行深度測序，從而可以高效準確的研究與疾病最相關(guān)的基因，并且高通量測序方法成本低、速度快、通量高，目前已經(jīng)成為臨床上多種疾病進行相關(guān)基因檢測和生命科學(xué)研究的重要工具[11-12]。本研究采用多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序方法對EC患者樣本進行檢測，MMR基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2突變類型的測序結(jié)果與Sanger測序結(jié)果一致，表明采用新一代高通量測序方法來檢測MMR基因的胚系突變的準確度可靠。86例豫西地區(qū)EC患者測序結(jié)果表明發(fā)生MMR基因突變的共有66例，總突變率為76.8%，說明豫西地區(qū)EC患者同時有MMR基因突變的概率高達76.8%。86例測序結(jié)果共發(fā)現(xiàn)12種非同義SNV、2種同義SNV。將本研究檢測出的突變位點在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中檢索分析，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致EC致病或可能致病的突變類型是位于MLH1基因上的18號外顯子p.Q701K：c.C2101A；而MSH2基因上的14號外顯子p.E809K：c.G2425A的突變是致病性不確定的類型；剩下的8種非同義SNV和2種同義SNV均為可容忍的變異可能與EC的發(fā)生沒有關(guān)聯(lián)。范怡梅等首次發(fā)現(xiàn)p.Q701K：c.C2101A突變，提高了患者患胃腸腫瘤的風(fēng)險[13]。YAP HL等在2例腫瘤樣本中檢測出p.Q701K：c.C2101A突變，但是在對照組非腫瘤樣本中未檢測出該突變，對2例突變樣本進行MSI檢測，共檢測出4個位點陽性[14]。本研究中致病或可能致病的類型p.Q701K：c.C2101A和p.E809K：c.G2425A的突變率高達11.6%，表明通過檢測MMR基因突變情況可以大概率的篩查出EC，因此針對EC高危人群，早期通過MMR基因檢測進行EC篩查顯得尤為重要，可以盡早進行治療干預(yù)。對EC患者復(fù)發(fā)情況隨訪，9例患者復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率高達10.5%。其中5例在5年內(nèi)復(fù)發(fā)，4例在5年后復(fù)發(fā)，不同年齡段復(fù)發(fā)例數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.5)；有家族史組復(fù)發(fā)6例，無家族史組3例，有家族史組明顯高于無家族史組(P<0.5)；無家族史組、有家族史組中位無瘤生存時間分別為：52.0個月、36.0個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.5)，隨訪調(diào)查表明EC術(shù)后易復(fù)發(fā)，無瘤生存時間短。文獻研究表明在EC患者中，有5%的子宮內(nèi)膜癌是和遺傳易感性有關(guān)的[3]。因此對于EC高危人群盡早進行MMR基因測序檢測，對患者早期治療及對臨床管理及指導(dǎo)用藥均具有重要意義。

國外對LS的研究已進行了多年，但在我國仍處于起步階段。對腸外腫瘤尤其是女性LS高發(fā)的EC的研究非常少，中國人群的EC的MMR基因大樣本研究還沒有開展。多重PCR靶向富集結(jié)合新一代高通量測序技術(shù)用于MMR基因的突變檢測成本低、速度快、通量高，可用于對EC高風(fēng)險女性的篩查，從而為EC臨床規(guī)范化治療提供更多資料。