侯東霞，侯麗青，烏云塔娜，冀云鵬，王曉華，冀小平

利用超聲檢查篩選唐氏綜合征和其他染色體非整倍體是現(xiàn)行產(chǎn)前胎兒評估的重要內(nèi)容，鼻骨發(fā)育異常是常見的超聲軟指標(biāo)之一，包括胎兒鼻骨缺失和鼻骨發(fā)育不良。研究顯示，妊娠中期21-三體胎兒鼻骨缺失或發(fā)育不良發(fā)生率達(dá)50%以上，正常胎兒鼻骨缺失或發(fā)育不良發(fā)生率則較低[1-3]。2013年國際婦產(chǎn)科超聲協(xié)會(huì)（ISUOG）發(fā)布了《妊娠早期超聲檢查指南》[4]，其中指出應(yīng)將鼻骨發(fā)育異常作為妊娠早期胎兒染色體非整倍體篩查的超聲指標(biāo)。美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)（ACOG）在其2016年發(fā)布的胎兒染色體非整倍體篩查指南中也提出應(yīng)將鼻骨缺失或發(fā)育不良作為胎兒染色體非整倍體篩查的有效超聲軟指標(biāo)[5]，說明了鼻骨缺失或發(fā)育不良對胎兒染色體非整倍體篩查的重要性。隨著近幾年遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，染色體微陣列分析技術(shù)（CMA）已廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，因此在鼻骨發(fā)育異常的胎兒中也發(fā)現(xiàn)了一定比例的染色體微缺失微重復(fù)[6-8]。本研究回顧性分析了92例鼻骨缺失或發(fā)育不良胎兒的臨床資料和染色體檢查結(jié)果，旨在探討鼻骨發(fā)育異常與染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)變異的相關(guān)性，為產(chǎn)前診斷提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年12月—2020年1月于內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院進(jìn)行產(chǎn)前超聲檢查并提示胎兒鼻骨缺失或發(fā)育不良的92例孕婦及胎兒為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：單胎妊娠，定期產(chǎn)檢，超聲檢查提示胎兒鼻骨發(fā)育異常，并接受介入性產(chǎn)前診斷；排除標(biāo)準(zhǔn)：多胎妊娠，患有妊娠期糖尿病、高血壓等，病歷資料不全。

92例孕婦年齡21～43歲，平均年齡（30.3±4.5）歲；高齡孕婦（≥35歲）19例，平均年齡（37.3±2.1）歲；孕周17+5～27+3周；胎兒鼻骨缺失5例，鼻骨發(fā)育不良87例。

本研究價(jià)值：

本研究結(jié)合臨床實(shí)際情況，分析了胎兒鼻骨發(fā)育異常合并常見的產(chǎn)前高危因素在預(yù)測胎兒染色體異常中的價(jià)值，以及染色體微陣列分析技術(shù)（CMA）在胎兒鼻骨發(fā)育異常遺傳學(xué)檢測中的應(yīng)用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)鼻骨缺失或發(fā)育不良的胎兒染色體異常發(fā)生率較高，且與基因組變異有關(guān)；染色體核型分析、CMA結(jié)合其他產(chǎn)前篩查高危因素將有效提高染色體異常的檢出率。

根據(jù)胎兒系統(tǒng)超聲結(jié)果可將鼻骨發(fā)育異常分為孤立性鼻骨發(fā)育異常和非孤立性鼻骨發(fā)育異常。孤立性鼻骨發(fā)育異常指超聲僅提示鼻骨發(fā)育異常，未發(fā)現(xiàn)其他系統(tǒng)器官異常，本研究共84例（91.3%）。非孤立性鼻骨發(fā)育異常指超聲提示鼻骨發(fā)育異常合并其他超聲軟指標(biāo)或器官系統(tǒng)異常，本研究共8例（8.7%），合并的異常包括室間隔缺損2例，脈絡(luò)叢囊腫2例，側(cè)腦室增寬、腎盂分離、十二指腸閉鎖、永久性右臍靜脈各1例。

其他產(chǎn)前檢查高危因素包括高齡產(chǎn)婦19例，胎兒頸項(xiàng)透明層（NT）增厚8例，血清學(xué)篩查（MSS）高風(fēng)險(xiǎn)6例，無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（NIPT）高風(fēng)險(xiǎn)8例。

本研究經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018倫函審〔010〕號），且所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 羊水細(xì)胞采集與分離 按照無菌操作要求，經(jīng)腹部行羊膜穿刺術(shù)抽取羊水30 ml，立即送往實(shí)驗(yàn)室。以1 500 r/min離心10 min，離心半徑17 cm，收集羊水細(xì)胞。20 ml羊水離心后用于細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析；10 ml羊水離心后經(jīng)Dulbecco磷酸鹽緩沖液（DPBS）清洗并用于CMA。

1.3 G顯帶核型分析 行常規(guī)羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備，經(jīng)收獲、制片、吉姆薩染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并由細(xì)胞遺傳工作站獲得G顯帶染色體分裂象圖。計(jì)數(shù)20個(gè)分裂象，分析5個(gè)核型，嵌合型計(jì)數(shù)增加至50～100個(gè)分裂相。根據(jù)國際人類染色體命名系統(tǒng)（ISCN-2016）確定染色體核型。

1.4 CMA 使用Promega公司（美國）DNA提取試劑盒，按照說明書提取培養(yǎng)的羊水細(xì)胞基因組DNA。使用Thermo fisher公司（美國）CytoScanTM750K芯片，按照試劑盒說明書，將基因組DNA經(jīng)酶切消化、接頭連接、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、片段化處理、標(biāo)記、預(yù)雜交，之后將雜交液注入芯片，進(jìn)行過夜雜交。次日，芯片經(jīng)洗滌、染色和掃描獲得數(shù)據(jù)，采用ChAS軟件進(jìn)行分析。通過在國際上常用的基因組與表型公共數(shù)據(jù)庫中比對查詢檢測到的基因組變異（CNV），包括正常人群基因組變異DGV數(shù)據(jù)庫（http://projects.tcag.ca/variationriatio），DECIPHER數(shù)據(jù)庫（https://decipher.sanger.ac.uk/），UCSC Genome Browser（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway），臨床基因組數(shù)據(jù)庫（ClinGene，http://www.clinicalgenome.org），在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http://www.omim.org），同時(shí)在PubMed數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示；計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體異常檢測結(jié)果 92例鼻骨發(fā)育異常胎兒中染色體核型分析檢出異常19例（20.6%），均為21-三體；CMA檢出異常25例（27.2%），其中19例為21-三體，6例為染色體微缺失微重復(fù)。

2.2 孤立性與非孤立性鼻骨發(fā)育異常胎兒染色體異常情況 孤立性與非孤立性鼻骨發(fā)育異常胎兒染色體異常發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.074，P=0.786，見表1）。

2.3 鼻骨發(fā)育異常合并其他產(chǎn)前篩查高危因素胎兒的染色體異常情況 與單純孤立性鼻骨發(fā)育異常胎兒相比，孤立性鼻骨發(fā)育異常+NT增厚、孤立性鼻骨發(fā)育異常+MSS高風(fēng)險(xiǎn)、孤立性鼻骨發(fā)育異常+NIPT高風(fēng)險(xiǎn)、孤立性鼻骨發(fā)育異常+2種及以上產(chǎn)前篩查高危因素胎兒染色體異常發(fā)生率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（χ2=7.851，P=0.005；χ2=5.439，P=0.020；χ2=15.088，P＜0.001；χ2=18.528，P＜0.001）。 單 純孤立性鼻骨發(fā)育異常與孤立性鼻骨發(fā)育異常+高齡孕婦胎兒染色體異常發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.176，P=0.140）。

非孤立性鼻骨發(fā)育異常+NT增厚或高齡孕婦胎兒與單純非孤立性鼻骨發(fā)育異常胎兒比較，病例數(shù)太少，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

鼻骨發(fā)育異常合并其他產(chǎn)前篩查高危因素胎兒染色體異常情況詳見表2。

表1 孤立性與非孤立性鼻骨發(fā)育異常胎兒染色體異常發(fā)生率〔n（%）〕Table 1 Incidence of chromosomal abnormalities in second-trimester fetuses with isolated and non-isolated nasal bone abnormalities

表2 鼻骨發(fā)育異常合并其他產(chǎn)前篩查高危因素胎兒染色體異常情況〔n（%）〕Table 2 Incidence of chromosomal abnormalities in second-trimester fetuses with nasal bone abnormalities and with nasal bone abnormalities with other risk factors for chromosome abnormalities

2.4 染色體微缺失微重復(fù)分析及患者妊娠結(jié)局 6例染色體微缺失微重復(fù)病例的拷貝數(shù)變異情況、CNV致病性及妊娠結(jié)局見表3。病例3～5均正常分娩生產(chǎn)，截至2020年3月，嬰兒月齡為4個(gè)月～2周歲；跟蹤回訪嬰幼兒發(fā)育情況，根據(jù)家長描述，3名嬰幼兒的體格和智力發(fā)育情況均可達(dá)到其年齡段的正常水平。病例6仍在妊娠中，目前未發(fā)現(xiàn)胎兒其他發(fā)育異常。病例5和病例6發(fā)生相同位點(diǎn)的CNV。

3 討論

3.1 胎兒鼻骨缺失或發(fā)育不良的鑒別 在胎兒發(fā)育過程中，鼻骨約于孕6周時(shí)形成，9周時(shí)開始骨化，11周時(shí)即可在超聲檢查中觀察到其結(jié)構(gòu)[2]。所謂鼻骨發(fā)育不良，是指胎兒鼻骨不同程度短小的超聲觀察結(jié)果。鼻骨缺失可以看作是鼻骨發(fā)育不良最嚴(yán)重的程度，相對容易識別。由于鼻骨發(fā)育不良與正常鼻骨長度之間的截?cái)嘀涤米骱Y選指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)、定義相對困難，因此，歷史上發(fā)展了各種標(biāo)準(zhǔn)來定義鼻骨發(fā)育不良，如雙頂徑與鼻骨比例[9-10]，鼻骨長度低于正常同孕周胎兒的第5百分位、第 2.5百分位[11-12]，鼻骨長度 ＜2.5 mm[1]，鼻前組織厚度與鼻骨長度的比值[13-14]。鼻骨的長度通過超聲胎兒面部的正中矢狀面進(jìn)行評估，理想情況下應(yīng)能看到3條回聲線，上端線代表皮膚，下方較厚且回聲較上端皮膚強(qiáng)代表鼻骨，第三條線幾乎與皮膚相連但略高一點(diǎn)，則代表鼻尖[15]。正常發(fā)育的情況下，胎兒鼻骨長度隨著孕周增加呈線性增加[2-3]，并且隨種族和民族而異[16-17]?，F(xiàn)在較多研究以鼻骨長度低于正常同孕周胎兒的第2.5百分位為標(biāo)準(zhǔn)判定鼻骨發(fā)育異常。本研究以妊娠中期鼻骨長度＜2.5 mm為鼻骨發(fā)育不良。

表3 6例染色體微缺失微重復(fù)患者CNV情況及妊娠結(jié)局Table 3 Copy number variations and pregnancy outcomes in 6 pregnant women with chromosomal microdeletions and microduplications

3.2 胎兒鼻骨發(fā)育異常與染色體異常的相關(guān)性 利用超聲標(biāo)記篩查唐氏綜合征和其他染色體非整倍體是產(chǎn)前胎兒評估的重要內(nèi)容。鼻骨是胎兒系統(tǒng)超聲顏面部檢查的一個(gè)重要軟指標(biāo)。大量研究表明，鼻骨缺失或發(fā)育不良與胎兒染色體核型異常之間存在相關(guān)性，鼻骨發(fā)育異常的胎兒染色體異常發(fā)生率為21.7%～51.7%[7-8，18]，其中21-三體最常見。本研究在92例鼻骨發(fā)育異常胎兒中檢出的19例非整倍體染色體異常均為21-三體。多篇文獻(xiàn)報(bào)道在常規(guī)妊娠中期超聲檢查中有33%～100%的唐氏綜合征胎兒為鼻骨缺失或發(fā)育不良，在染色體正常胎兒中則為 0.39%～1.80%[1-3，19-20]，說明鼻骨發(fā)育異常與21-三體有較高的相關(guān)性。GEIPEL等[18]研究結(jié)果顯示，在頸褶厚度、鼻骨發(fā)育不良、靜脈導(dǎo)管回流及右房室瓣返流4個(gè)超聲指標(biāo)中鼻骨發(fā)育不良對鑒別21-三體胎兒最為敏感。ALLDRED等[21]總結(jié)了早期妊娠超聲篩查唐氏綜合征的11個(gè)超聲指標(biāo)，其中鼻骨缺失為預(yù)測唐氏綜合征胎兒特異度最高的指標(biāo)，且50%的唐氏妊娠中可發(fā)現(xiàn)這一特征，說明相比于其他常見的染色體超聲軟指標(biāo)，鼻骨發(fā)育異常與21-三體相關(guān)性更高。除21-三體外，鼻骨發(fā)育異常胎兒中常見的染色體非整倍體還有18-三體、13-三體和性染色體異常[7-8，18，22]。胎兒鼻骨發(fā)育異常已成為產(chǎn)前染色體非整倍體篩查的一個(gè)重要臨床指征。ISUOG和ACOG分別在2013年和2016年發(fā)布的產(chǎn)前篩查指南中指出了鼻骨缺失或發(fā)育不良對胎兒染色體非整倍體篩查的重要性[4-5]。此外，其他類型染色體異常，如三倍體和微缺失微重復(fù)，也在以鼻骨發(fā)育異常為產(chǎn)前診斷指征的胎兒中被發(fā)現(xiàn)[18，22]。

本研究比較了妊娠中期超聲提示孤立性鼻骨發(fā)育異常與非孤立性鼻骨發(fā)育異常胎兒的染色體異常發(fā)生率，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)差異，但在多篇文獻(xiàn)中顯示，鼻骨缺失或發(fā)育不良合并其他妊娠中期超聲軟指標(biāo)異常時(shí)對21-三體及其他染色體異常的預(yù)測率遠(yuǎn)高于孤立性鼻骨發(fā)育異常[8，18，22]。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)不符，可能原因是非孤立性鼻骨發(fā)育異常樣本數(shù)量較少。根據(jù)納入本研究病例的產(chǎn)前診斷指征，筆者進(jìn)一步分析了孤立性與非孤立性鼻骨發(fā)育異常合并其他產(chǎn)前篩查高危因素胎兒染色體異常發(fā)生率，結(jié)果顯示，孤立性鼻骨發(fā)育異常合并NT增厚、MMS高風(fēng)險(xiǎn)、NIPT高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)染色體異常發(fā)生率均顯著上升；合并2種及以上產(chǎn)前篩查因素時(shí)染色體異常發(fā)生率可達(dá)100.0%。由此可見，孤立性鼻骨發(fā)育異常合并其他產(chǎn)前篩查高危因素時(shí)多提示預(yù)后不良。有文獻(xiàn)指出，鼻骨發(fā)育異常和MSS高風(fēng)險(xiǎn)因素結(jié)合提高了染色體非整倍體篩選試驗(yàn)的性能[22]。HAS等[19]報(bào)道將鼻骨發(fā)育評估和NT風(fēng)險(xiǎn)評估聯(lián)合時(shí)21-三體的檢出率雖沒有改變，但假陽性率下降，說明鼻骨發(fā)育異常合并其他產(chǎn)前篩查高危因素時(shí)其與染色體異常的相關(guān)性極大提升。本研究結(jié)果顯示當(dāng)鼻骨發(fā)育異常合并其他產(chǎn)前篩查高危因素時(shí)染色體異常為21-三體，微缺失微重復(fù)均出現(xiàn)在單純的超聲異常病例中，提示超聲異常但核型正常的病例應(yīng)當(dāng)行CMA。

3.3 胎兒鼻骨發(fā)育異常與染色體微缺失微重復(fù) 本研究采用CMA在染色體核型正常的胎兒中又發(fā)現(xiàn)了6例微缺失微重復(fù)，較染色體核型分析多檢出6.5%（6/92）的染色體異常。歐陽魯平等[23]進(jìn)行的一項(xiàng)針對241例鼻骨發(fā)育異常胎兒的研究顯示，SNP-array較染色體核型分析多檢出5.4%的染色體異常。在應(yīng)用CMA檢測胎兒鼻骨發(fā)育異常的臨床研究中，常檢出染色體的微缺失微重復(fù)[24-25]。致病性CNV在鼻骨發(fā)育異常胎兒中的發(fā)現(xiàn)說明二者間存在潛在的相關(guān)性，但是目前的研究還未顯示這種相關(guān)性具體與哪些CNV聯(lián)系更密切。

本研究2例可能致病性CNV病例中1例為17q24.1q24.2缺失3.6 Mb，位于該片段內(nèi)的缺失性CNV病例已被報(bào)道與多種畸形、生長發(fā)育遲緩和智力障礙等有關(guān)[26-27]，說明這一CNV表型譜較廣，鼻骨的發(fā)育可能受到其影響；另1例為X染色體上DMD基因部分重復(fù)，目前沒有證據(jù)顯示DMD基因與鼻骨發(fā)育有直接關(guān)系，且DMD基因異常導(dǎo)致的表型是相對特異的，鼻骨發(fā)育異常的胎兒中也可能檢測到并不相關(guān)的CNV變異，這種情況在臨床中時(shí)有遇到。本研究4例臨床意義不明的CNV病例中有2例同為15q11.2重復(fù)518 kb，這一變異在DGV和DECIPHER數(shù)據(jù)庫中有較多記錄。15q11.2重復(fù)在人群中外顯率不同，攜帶此變異者有的表現(xiàn)為正常，也有的表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力障礙和多發(fā)畸形等，且親代與子代間表現(xiàn)也可能不同[28-29]。基于這一變異的表型多樣性，推測其與鼻骨發(fā)育異常之間可能存在關(guān)聯(lián)。此類在人群中外顯率差異性較大的CNV，在產(chǎn)前病例中應(yīng)報(bào)告為臨床意義不明，在產(chǎn)后病例中可根據(jù)患者表型進(jìn)行報(bào)告。

綜上所述，胎兒鼻骨缺失或發(fā)育不良是產(chǎn)前診斷的重要指征，孤立性或非孤立性鼻骨發(fā)育異常均與染色體異常有較高的相關(guān)性，且染色體異常類型包括染色體非整倍體與微缺失微重復(fù)。妊娠中期鼻骨發(fā)育異常合并其他產(chǎn)前篩查高危險(xiǎn)因素時(shí)染色體異常發(fā)生率升高，多提示預(yù)后不良。CMA應(yīng)用于鼻骨發(fā)育異常胎兒的染色體檢測，可檢出染色體核型分析不能發(fā)現(xiàn)的致病性CNV，使染色體異常檢出率提高，但同時(shí)也面臨著一些CNV致病性不明確的挑戰(zhàn)?？傮w來說，常規(guī)染色體核型分析結(jié)合CMA應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，可為鼻骨發(fā)育異常胎兒的遺傳咨詢、預(yù)后評估和臨床決策提供更全面的遺傳學(xué)信息，建議在臨床中推廣應(yīng)用。

作者貢獻(xiàn)：侯東霞進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，撰寫論文；侯東霞、冀云鵬進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；侯東霞、侯麗青進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；侯麗青進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；烏云塔娜進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；冀云鵬、冀小平進(jìn)行論文的修訂；王曉華負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；王曉華、冀小平對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。