潘 劍，韋 煜，葉定偉，朱 耀

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

前列腺癌是世界范圍內(nèi)男性第二大常見惡性腫瘤［1］。雖然局限性前列腺癌患者的5年生存率接近100%，但轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌目前仍然無法治愈［2-3］?？紤]到只有12%的前列腺癌患者死于該疾病，區(qū)分侵襲性和惰性前列腺癌仍然是一個(gè)重要的臨床問題，因此尋找一種可以輔助判斷腫瘤的早期侵襲情況、復(fù)發(fā)可能性并預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移部位的標(biāo)志物十分必要，有望為患者提供個(gè)性化的治療。

對(duì)于預(yù)測(cè)前列腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，最優(yōu)決策是建立在包括臨床分期、Gleason評(píng)分等臨床變量的列線圖指導(dǎo)評(píng)分和前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）值之上的。但隨著高通量測(cè)序方法的出現(xiàn)，越來越多的研究將評(píng)估基因組生物標(biāo)志物作為對(duì)前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分層的變量。人類基因組中最常見的遺傳變異是單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。有研究［4］發(fā)現(xiàn)，SNP與前列腺癌易感基因位點(diǎn)、雄激素生物合成之間存在關(guān)聯(lián)。SNP也被發(fā)現(xiàn)是前列腺癌的預(yù)后標(biāo)志物，Van Den Broeck等［5］的綜述指出，特定的SNP位點(diǎn)變異與前列腺癌的常規(guī)治療效果、不良反應(yīng)及復(fù)發(fā)概率之間存在關(guān)聯(lián)。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與前列腺癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展［6-8］。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在前列腺腫癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［9-10］。EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前所知最主要和研究最深入的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的受體酪氨酸激酶通路［11-12］，在生長(zhǎng)因子調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和功能的多個(gè)過程中發(fā)揮著重要的生理作用。已有研究表明，EGFR表達(dá)與前列腺癌的高分級(jí)、晚分期、復(fù)發(fā)［13］和骨轉(zhuǎn)移［14］相關(guān)。此外，EGFR也被證明可以調(diào)控骨發(fā)育［15］。作為EMT、分化、增殖和血管生成的調(diào)節(jié)因子之一，EGFR可能啟動(dòng)和（或）促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，因此被認(rèn)為可能是預(yù)測(cè)高轉(zhuǎn)移潛能的替代標(biāo)志物［14］。39%～47%的前列腺癌表達(dá)EGFR［16］，并且在前列腺癌進(jìn)展到晚期雄激素非依賴性階段時(shí)也能觀察到EGFR的表達(dá)增加［17］。在包括前列腺腫瘤在內(nèi)的臨床前腫瘤模型中，EGFR的表達(dá)可能與不良表型增殖、血管生成和遷移直接相關(guān)［18-20］，并與腫瘤的放射可治愈性負(fù)相關(guān)［21-22］。

EGFR（rs884419）基因多態(tài)性與中國(guó)前列腺癌患者包括轉(zhuǎn)移負(fù)荷在內(nèi)的病理學(xué)特征的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。本研究旨在對(duì)比EGFR（rs884419）基因變異頻率在中國(guó)與西方人群前列腺癌中的分布差異，并基于中國(guó)前列腺癌患者的突變特征，分析EGFR（rs884419）基因多態(tài)性與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性并評(píng)估EGFR對(duì)轉(zhuǎn)移情況的預(yù)測(cè)效能。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2014—2019年連續(xù)收治的182例前列腺癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診為前列腺腺癌，無神經(jīng)內(nèi)分泌分化、無印戒細(xì)胞癌或小細(xì)胞癌分化；年齡≥18歲；患者自愿簽署知情同意書，同意將血液樣本及臨床資料用于本研究。

1.2 基因測(cè)序

檢測(cè)EGFR（rs884419）基因在納入的182例患者外周血白細(xì)胞DNA中的多態(tài)性情況。提取患者血液中的DNA，采用DNA提取試劑盒對(duì)其進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，EGFR引物的下游引物為5'-GACAGACTG GATAAAGAAAATTGTGGTACA-3'，上游引物5'-CTCCATCCATGTTCTTGCAAAGTAC-3'。反應(yīng)條件：將DNA在98 ℃下進(jìn)行變性，持續(xù)15 s；在52 ℃下進(jìn)行退火，持續(xù)20 s；在68 ℃下進(jìn)行擴(kuò)增，持續(xù)20 s，共38個(gè)循環(huán)。

1.3 文獻(xiàn)納入情況

采用關(guān)鍵詞“prostate carcinoma”O(jiān)R“prostate cancer”AND“polymorphism”AND“EGFR”在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索；用“EGFR”、“前列腺癌”等關(guān)鍵詞在中國(guó)知網(wǎng)和萬方等數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索。限定檢索時(shí)間為2000年1月1日—2021年4月1日。文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①在2021年4月1日之前發(fā)表的與前列腺癌和EGFR基因相關(guān)的中英文研究；②研究對(duì)象為人類，而不是機(jī)制研究；③有具體的基因數(shù)據(jù)。文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)：①同一人群基因數(shù)據(jù)的重復(fù)報(bào)道；②存在嚴(yán)重偏倚的數(shù)據(jù)。納入文獻(xiàn)的基本情況見表1。

表1 美國(guó)和中國(guó)EGFR（rs884419）基因的各基因型分布Tab.1 Distribution of genotypes of EGFR (rs884419) gene in the America and China

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料（如年齡）分析采用非配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料（如基線PSA、基因型頻率、轉(zhuǎn)移負(fù)荷情況等）分析則采用Fisher精確檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)為雙側(cè)。所有的統(tǒng)計(jì)過程均采用R-Studio軟件完成。

2 結(jié)果

根據(jù)所設(shè)定的文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最后僅有一篇文獻(xiàn)納入分析（表1）［23］。本研究將EGFR（rs884419）基因型為AG和AA的患者命名為變異組，基因型為GG的患者命名為正常組。所納入文獻(xiàn)包含196例美國(guó)前列腺癌患者，其中至少1個(gè)EGFR（rs884419）基因變異位點(diǎn)的患者占20.4%（40/196），復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的182例前列腺癌患者中，攜帶至少1個(gè)EGFR（rs884419）基因變異位點(diǎn)（數(shù)據(jù)符合Hardy-Weinberg平衡）的患者占79.1%（144/182），中國(guó)前列腺癌的EGFR（rs884419）變異頻率顯著高于美國(guó)（P＜0.001，圖1）。

圖1 EGFR基因突變頻率Fig.1 Mutation frequency of EGFR

在對(duì)EGFR（rs884419）基因型與前列腺癌臨床病理學(xué)特征進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因型與患者初診時(shí)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)，正常組患者初診時(shí)為M1期的概率較變異組高（P=0.028）；而EGFR（rs884419）基因與患者確診時(shí)的年齡、確診時(shí)的PSA水平、Gleason評(píng)分及轉(zhuǎn)移負(fù)荷均無相關(guān)性（P＞0.05，表2，圖2）。

圖2 不同臨床特征中基因型分布Fig.2 Distribution of genotype in different clinical characteristics

表2 患者的臨床病理學(xué)特征Tab.2 Clinicopathologic characteristics of patients (n)

3 討論

EGFR基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，受到基因多態(tài)性的影響。目前針對(duì)EGFR基因與臨床病理學(xué)特征關(guān)系的研究罕見報(bào)道。本研究對(duì)中國(guó)人群前列腺癌患者EGFR（rs884419）基因多態(tài)性進(jìn)行了分析。一方面，在與其他人種的對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，中國(guó)前列腺癌患者rs884419位點(diǎn)的變異頻率較美國(guó)高，提示與美國(guó)前列腺癌患者相比，理論上EGFR基因型對(duì)于預(yù)測(cè)中國(guó)前列腺癌患者轉(zhuǎn)移狀態(tài)與治療效果的效力更好。另一方面，基因型為GG型的患者有著更高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率，可能意味著在rs884419位點(diǎn)發(fā)生變異后，EGFR基因表達(dá)降低，抑制了腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處侵襲能力，最終使得患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移概率降低。

Xie等［24］研究表明，EGFR基因狀態(tài)與前列腺癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，EGFR基因的高表達(dá)與較短的無轉(zhuǎn)移生存期相關(guān)。還有研究顯示，EGFR表達(dá)與EMT相關(guān)［25-26］，而EMT可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和存活［6］。相比于EGFR正?；虻捅磉_(dá)的腫瘤組織，EGFR高表達(dá)的腫瘤組織內(nèi)有大量的血管和（或）淋巴管，可以促進(jìn)癌細(xì)胞經(jīng)血液和淋巴途徑播散，使其侵襲能力增強(qiáng)［27］。Nasta?y等［28］的研究則顯示，EGFR高表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞中，剛性基質(zhì)的產(chǎn)生顯著增加，由此推測(cè)EGFR也許可以促進(jìn)細(xì)胞在剛性基質(zhì)上的生長(zhǎng)，最終促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。而Day等［14］的研究也證實(shí)EGFR蛋白的高水平與前列腺癌進(jìn)展及骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。

EGFR也可以在其他方面促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展，如促進(jìn)腫瘤的自我更新等。有一些證據(jù)支持該觀點(diǎn)，即添加到培養(yǎng)基中的表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）可促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)［29］，而EGFR的激活會(huì)增加前列腺微球體的形成［30］。Perez等［23］進(jìn)行了一項(xiàng)回顧性分子流行病學(xué)研究，提示EGFR基因的rs884419位點(diǎn)是前列腺癌根治術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的遺傳標(biāo)記。盡管目前尚不清楚rs884419發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，但由于該SNP位于CREB、SREBF、ZNF和KLF1的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，rs884419位點(diǎn)的多態(tài)性差異可能會(huì)通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)影響轉(zhuǎn)錄，最終引起蛋白功能的改變。

為探索不同EGFR基因型對(duì)前列腺癌惡性程度的影響，本研究評(píng)估了EGFR（rs884419）基因多態(tài)性與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性。但本研究存在一些不足之處：首先，單中心數(shù)據(jù)不可避免地存在人群選擇性偏倚，但非選擇性、連續(xù)性入組的方式降低了選擇偏倚帶來的誤差；其次，有限的樣本數(shù)在一定程度上會(huì)影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性；最后，由于隨訪時(shí)間有限及部分患者治療線數(shù)的不同，本研究沒有展示根據(jù)基因型區(qū)分的治療數(shù)據(jù)。