吳 冉，王桂珍，程 昕,3，周光飚

1.貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)系，貴州 貴陽 550025；

2.國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京 100021；

3.哈佛醫(yī)學(xué)院達(dá)納-法伯癌癥研究所癌癥生物學(xué)系，馬薩諸塞州 波士頓 02215

不同微量元素在生物體內(nèi)發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，并在一定程度上參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展［1］。銅作為酪氨酸激酶及銅藍(lán)蛋白等多種酶的關(guān)鍵輔助因子，在生物體的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。有研究［2］表明，銅是維持機(jī)體正常生物學(xué)功能的必需微量元素，具有氧化還原性質(zhì)，能維持生物體內(nèi)催化、氧化、細(xì)胞呼吸及各類生命活動。此外，也有研究［3］指出，銅離子能調(diào)節(jié)腫瘤的氧化磷酸化和生長過程，可參與致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路BRAF轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤發(fā)生［4］，對生物體有一定的潛在毒性［5］。因此，生物體的銅離子含量應(yīng)該維持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，否則將會破壞生物體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，從而造成不必要的傷害。

研究表明，破壞銅離子在體內(nèi)的平衡可能會促進(jìn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展。由于銅離子在許多生物學(xué)過程中是重要的輔助因子，在不同的癌癥表型中常會出現(xiàn)銅離子的身影，例如銅可以通過激活參與細(xì)胞生長和代謝的酶LOX、SPARC、MEK1和MEMO1來增強(qiáng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力［6］。飲食中銅和鋅的攝入量與患肺癌風(fēng)險相關(guān)［7-8］。銅是多種金屬酶活性必需的微量元素之一，血清中銅或鐵含量較高的人，會增加死于癌癥的風(fēng)險［9］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血清中銅離子含量比健康對照組高［10-11］，且肺癌患者癌組織中的銅、鈣、鎂和鋅含量也顯著高于正常肺組織［12-13］。但這些研究主要報道了患者血清或癌組織中的主要/微量元素含量的異常變化，而在細(xì)胞水平上研究銅離子濃度對細(xì)胞的增殖及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響的報道較少。肺癌是全世界最常見的癌癥，每年有210萬新發(fā)及180萬死亡病例，在中國，肺癌也是最常見的癌癥，每年新發(fā)及死亡病例分別為78.7萬及63.1萬［14-15］。本文以肺癌作為腫瘤模型，系統(tǒng)性研究銅離子濃度對細(xì)胞增殖的影響及其銅伴侶蛋白編碼基因在肺癌發(fā)展和預(yù)后中的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人正常肺上皮細(xì)胞系16HBE由國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室傳代培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶及胎牛血清均購自美國Gibco公司，A/J小鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司，脫脂奶粉購自美國BD公司，抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）抗體、抗磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）抗體均購自美國CST公司，抗β-actin抗體購自美國Sigma公司，化學(xué)發(fā)光液購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞生長曲線實驗

將A549細(xì)胞和16HBE細(xì)胞接種于6孔板中，每孔0.8×105個細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁完全后，實驗組用濃度為5 μmol/L的Cu2+溶液分別處理A549和16HBE細(xì)胞，對照組用等體積溶劑進(jìn)行處理，分別于加藥后24、48和72 h，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色后計數(shù)，每個實驗重復(fù)3次后，用GraphPad Prism 7軟件繪制生長曲線圖。

1.2.2 蛋白樣品的制備及蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）實驗

將16HBE細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，將含不同濃度的銅離子溶液與細(xì)胞一起溫育48 h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌3次。然后將濃度為1×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）的上樣緩沖液（每3×105個細(xì)胞加入100 μL上樣緩沖液）加入6孔板中，用預(yù)冷的細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，并轉(zhuǎn)至Eppendorf試管中。將上述Eppendorf試管置于99 ℃水浴鍋煮12 min，每間隔3 min用渦旋儀振蕩混勻1次，得到的蛋白樣品用12 000 r/min離心1 min后取10 μL的蛋白量進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）；濕轉(zhuǎn)至NC膜上，在電壓為110 V條件下轉(zhuǎn)膜2 h。取出NC膜并放入提前配置好的含5%脫脂奶粉的1×洗膜緩沖液（tris-buffered saline Tween，TBST）中，室溫放置1～2 h，用一抗稀釋液以1∶1 000比例稀釋抗p-ERK、抗ERK和抗β-actin抗體，將上述封閉后的NC膜放入目的抗體溶液中，4 ℃平板搖床溫育過夜，第2天用TBST洗膜3次，每次10 min；再放入稀釋好的帶辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗中，常溫溫育1～2 h后，用TBST洗膜3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。

1.2.3 構(gòu)建動物肺癌模型

4～5周齡雌性A/J小鼠在SPF級別動物房中飼養(yǎng)，對小鼠進(jìn)行編號，待小鼠充分適應(yīng)動物房無菌環(huán)境1周后開始給予煙草致癌物4-甲基亞硝銨-1-(3-吡啶基)-1-丁酮［4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK］，來誘發(fā)小鼠產(chǎn)生肺癌。將A/J小鼠隨機(jī)分為對照組和NNK組，每組10只。通過灌胃方式給予NNK組小鼠100 mg/kg的NNK，1周兩次，連續(xù)5周。同時對照組小鼠給予相同體積的溶劑。在灌胃結(jié)束后，通過頸椎脫臼法處死小鼠，并將小鼠的肺組織取出，放置-80 ℃保存，以備后續(xù)實驗。本研究的所有動物實驗均按照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院動物管理與使用委員會批準(zhǔn)的指南進(jìn)行。

1.2.4 H-E染色

將40%的甲醛溶液固定、石蠟包埋的小鼠肺組織標(biāo)本切成5 μm厚的切片，通過二甲苯脫蠟和不同濃度的乙醇對切片進(jìn)行脫蠟處理。隨后用蘇木精染色5 min，用鹽酸乙醇分化后，用伊紅染液染色1～3 min；經(jīng)過不同濃度梯度的乙醇與二甲苯徹底脫水透明后，用中性樹膠封蓋，在普通光鏡下觀察組織形態(tài)。

1.2.5 小鼠體內(nèi)銅離子的檢測

對小鼠肺組織樣品進(jìn)行稱重，取200 mg肺癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織，液氮冷凍狀態(tài)下研磨成粉末。將粉末在預(yù)冷的混合酸（HNO3∶HClO4=1∶1）中過夜，并轉(zhuǎn)移至5 mL去離子水中，隨后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（inductively-coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）對銅離子濃度進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和Oncomine等數(shù)據(jù)庫分析銅伴侶蛋白超氧化物歧化酶（copper chaperone for superoxide dismutase，CCS）、細(xì)胞色素C氧化酶銅伴侶蛋白17（cytochrome C oxidase copper chaperone 17，COX17）和抗氧化劑1銅伴侶蛋白（antioxidant 1 copper chaperone，ATOX1）在患者中的表達(dá)情況，利用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析上述基因表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。在GraphPad Prism 8軟件中采用雙尾Student’st檢驗對實驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銅離子促進(jìn)細(xì)胞增殖

用濃度為5 μmol/L的銅離子溶液處理人肺癌細(xì)胞A549，同時用等體積溶劑處理對照組細(xì)胞，并于第1、2和3天檢測細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，相較于對照組，用含銅離子的溶液處理細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)目明顯增加（P=0.038 6），說明銅離子能促進(jìn)A549的增殖（圖1A）。在正常人肺上皮細(xì)胞來源的16HBE細(xì)胞中，濃度為5 μmol/L的銅離子也可促進(jìn)細(xì)胞增殖，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.031 4，圖1B）。上述結(jié)果表明銅離子可促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖1 銅離子促進(jìn)A549和16HBE細(xì)胞增殖Fig.1 Copper ions promote the proliferation of A549 and 16HBE cells

2.2 銅離子能提高細(xì)胞內(nèi)ERK的磷酸化水平

ERK作為一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是傳遞絲裂原信號的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，也是多種生長因子的下游蛋白，能通過被磷酸化參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和存活等［16］。本研究分析了銅離子對細(xì)胞內(nèi)ERK信號通路的影響，用濃度為2.5、5.0和10.0 μmol/L的銅離子溶液處理16HBE細(xì)胞，并于48 h后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，通過Western blot檢測p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著銅離子濃度的升高，p-ERK蛋白的表達(dá)量也隨之升高（圖2A、2B），說明銅離子能在一定程度上誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ERK的磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖2 銅離子對16HBE細(xì)胞內(nèi)ERK的影響Fig.2 The effects of copper ions on ERK in 16HBE cells

2.3 小鼠肺癌組織中銅離子的含量高于正常組織

將A/J小鼠在SPF級別的動物房中飼養(yǎng)并用耳號進(jìn)行標(biāo)記，隨機(jī)分為兩組。1周后通過對小鼠給予NNK建立小鼠肺癌模型。每周詳細(xì)觀察并記錄小鼠的體重和狀態(tài)，用小動物計算機(jī)體層顯像儀（small animal computed tomography，micro-CT）成像和對小鼠肺組織取材觀測小鼠肺部腫瘤生長情況，并通過H-E染色鑒定腫瘤類型。實驗結(jié)果顯示，NNK可以誘發(fā)小鼠肺癌的產(chǎn)生（圖3A）。進(jìn)一步通過ICP-MS檢測小鼠肺癌組織和正常肺組織的銅離子含量，結(jié)果表明，小鼠肺癌組織中的銅離子含量高于正常肺組織（圖3B）。

圖3 小鼠肺癌組織中的銅離子含量高于正常肺組織Fig.3 Copper ion concentration was higher in mouse lung cancer tissues than in normal lung tissues

2.4 銅伴侶蛋白編碼基因在肺癌組織中高表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)，銅離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，主要通過CCS、COX17和ATOX1等，實現(xiàn)銅離子在不同細(xì)胞器中的運輸，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能［17］。因此，本研究利用多種數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步分析了銅伴侶蛋白編碼基因在肺癌患者癌組織和正常組織中的表達(dá)差異。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中肺癌患者數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌患者中，肺癌組織中的CCS、COX17和ATOX1基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常肺組織（圖4A～4C）。此外，通過對Oncomine基因芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在Garber、Stearman、Okayama、Su、Hou和Selamat數(shù)據(jù)中，肺癌組織中的CCS基因的mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織（圖4D）；在Garber、Okayama和Wachi數(shù)據(jù)中，肺癌組織中的COX17基因的mRNA表達(dá)水平也高于癌旁組織（圖4E）；在Garber、Okayama、Hou和Landi數(shù)據(jù)中，肺癌組織中的ATOX1基因的mRNA表達(dá)水平也高于癌旁組織（圖4F）。

圖4 銅伴侶蛋白編碼基因CCS、COX17和ATOX1在肺癌患者癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常肺組織Fig.4 The expression levels of copper chaperone protein-encoding genes CCS,COX17 and ATOX1 were significantly higher in cancer tissues than in normal lung tissues

2.5 銅伴侶蛋白編碼基因與患者預(yù)后的關(guān)系

為進(jìn)一步研究銅伴侶蛋白編碼基因CCS、COX17和ATOX1與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，利用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站對3個銅伴侶蛋白編碼基因的表達(dá)水平與肺癌患者的預(yù)后進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明，在肺腺癌患者中，銅伴侶蛋白編碼基因CCS、COX17和ATOX1的表達(dá)水平與患者的預(yù)后及生存呈負(fù)相關(guān)（圖5），說明肺癌患者體內(nèi)銅伴侶蛋白的表達(dá)水平可作為判斷患者臨床療效和評估預(yù)后的依據(jù)。

圖5 銅伴侶蛋白編碼基因的表達(dá)水平與肺腺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)Fig.5 The expression levels of copper chaperone protein-encoding genes were negatively correlated with prognosis of patients with lung adenocarcinoma

3 討 論

銅離子是人體生命活動所必需的一種重要微量元素。人體內(nèi)銅離子的含量異常往往會引起一系列的疾?。?8］。本研究發(fā)現(xiàn)，銅離子可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的增殖。有研究［19］發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)羊的胰腺類器官時，銅離子能以ATOX1依賴的方式直接結(jié)合MEK，從而激活MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而小鼠細(xì)胞中銅離子轉(zhuǎn)運蛋白1（copper transporter 1，CTR1）的缺失和突變都可降低MEK1磷酸化ERK的能力，說明MEK1-ERK相互作用需要銅離子的參與，而銅離子伴侶蛋白ATOX1和CTR1在銅離子與MEK的直接結(jié)合中均扮演重要角色。此外，二價銅離子可啟動兩種受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）介導(dǎo)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括AKT和ERK［20］，說明銅離子還可能參與RTK的激活，從而導(dǎo)致ERK的磷酸化。

吸煙是引發(fā)肺癌的主要外因，吸煙者發(fā)生肺癌的風(fēng)險是非吸煙者的20～30倍，且二手煙也會增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險［21］，吸煙可引起各種類型的肺癌［22］。煙草燃燒產(chǎn)生的煙霧中有60多種已知的致癌物，包括多環(huán)芳烴類（如苯并芘）、苯、丙烯及亞硝胺類（如NNK）［23］。這些致癌物一般先與DNA形成加合物，再直接或間接誘使抑癌基因如TP53突變失活或癌基因如KRAS突變激活［23-25］。對亞硝胺類敏感的CYP2E1一般誘發(fā)肺腺癌［26］。在Cu2+和NADPH的存在下，亞硝胺的代謝物NNK和NNN能夠產(chǎn)生顯著水平的DNA氧化，從而增加癌癥發(fā)生的風(fēng)險；同時，香煙煙霧中也含有大量的金屬離子，其中也包括銅離子；電子煙中的銅離子含量甚至可以達(dá)到普通香煙的6倍，這進(jìn)一步解釋了肺癌組織中高濃度銅離子的來源［27］。

在機(jī)體正常組織中，銅離子主要通過銅伴侶蛋白來實現(xiàn)在不同細(xì)胞器中的運輸，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。目前，銅伴侶蛋白是腫瘤研究的熱點。本研究發(fā)現(xiàn)，CCS、COX17和ATOX1在人肺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，且這些蛋白的表達(dá)水平與肺癌患者的預(yù)后和生存呈負(fù)相關(guān)，這在一定程度上說明高濃度的銅離子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。銅離子濃度與腫瘤的惡性程度顯著相關(guān)，也預(yù)示著銅伴侶蛋白可作為判斷患者臨床療效和評估預(yù)后的一項依據(jù)。ATOX1和CCS7都是銅離子發(fā)揮生物學(xué)功能不可或缺的蛋白，且二者與銅離子相結(jié)合的結(jié)構(gòu)區(qū)域有一定的相似性。抑制劑DC_AC50可以通過結(jié)合ATOX1和CCS的銅轉(zhuǎn)運界面，阻斷銅離子在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，在裸鼠移植瘤模型中表現(xiàn)出顯著的抑瘤效果［28］。COX17與銅離子的作用方式則不同于ATOX1和CCS。COX17主要存在于細(xì)胞線粒體膜結(jié)構(gòu)中，COX17與銅離子作用后可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。也有研究［29-30］發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人類細(xì)胞環(huán)境中，MEK1銅離子結(jié)合區(qū)的突變會降低BRAFV600E突變驅(qū)動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤發(fā)生，而銅離子螯合劑對這類突變型的腫瘤有著顯著療效，說明無論是通過螯合治療降低銅離子的濃度，還是通過抑制劑抑制銅離子的轉(zhuǎn)運，對腫瘤細(xì)胞都有著一定的抑制作用，減少銅離子對癌細(xì)胞內(nèi)惡性通路的激活是十分有潛力的治療方向。然而，由于銅離子本身是一種重要的必需微量元素，而目前大部分銅配體藥物均是采取全身給藥方式，不加甄別地實現(xiàn)全身銅耗竭，因此往往會導(dǎo)致一些不良反應(yīng)，例如影響銅離子與血管生成素的結(jié)合及新生血管生成等，最終導(dǎo)致紅斑、視神經(jīng)炎、嘔吐和白細(xì)胞減少等不良反應(yīng)［31］。因此，如何在開發(fā)靶向銅離子藥物及給藥系統(tǒng)的同時避免影響其正常的生理功能，將是未來研究的重點。

本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度銅離子能誘導(dǎo)ERK磷酸化，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并探索了銅離子在腫瘤組織與正常組織中的濃度差異。ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活除了與細(xì)胞的增殖和生存相關(guān)外，還可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［32-33］。因此，在今后的研究中，可以結(jié)合其可能的對人體免疫調(diào)節(jié)作用，綜合研究銅離子促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。此外，本研究表明，銅伴侶蛋白編碼基因表達(dá)水平與肺癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，因此可以通過抑制銅伴侶蛋白的作用，減弱腫瘤細(xì)胞對銅離子的過量攝取和阻斷銅離子參與的腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，從而為腫瘤治療提供新的思路。