武鴻文，梅 艷，王 喬，袁 佳，趙立威

四川省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041

甲狀腺結(jié)節(jié)是人體常見的一種內(nèi)分泌疾病，若不積極干預(yù)可發(fā)展為甲狀腺癌。甲狀腺癌作為人體內(nèi)分泌系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率雖只占惡性腫瘤1%左右，但近年來甲狀腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢［1］。甲狀腺癌患者主要臨床表現(xiàn)包括甲狀腺占位或頸部淋巴結(jié)腫大、吞咽困難、聲音嘶啞等［2］。因此，盡早診斷甲狀腺癌對于患者治療方案的選擇及預(yù)后具有重要意義。血清胸苷激酶1（serum-thymidine kinase 1，S-TK1）是新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤血清標(biāo)志物，在診斷腫瘤良惡性方面具有較高的診斷價(jià)值，有研究［3］發(fā)現(xiàn)，S-TK1表達(dá)水平與甲狀腺癌的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)。巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）是人體內(nèi)的一種重要趨化因子，亦稱CC族趨化因子配體3（CC chemokine ligand 3，CCL3），MIP-1α不僅可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞在炎癥部位的聚集，近年來有臨床研究［4］表明，肝癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤患者血清中MIP-1α呈高表達(dá)。因此，S-TK1、MIP-1α可以作為甲狀腺癌患者術(shù)前診斷、疾病治療及預(yù)后評估的重要血清標(biāo)志物。本研究通過檢測甲狀腺癌患者血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平，探討兩者表達(dá)水平與甲狀腺癌診斷、預(yù)后評估及術(shù)后療效的相關(guān)性，同時(shí)對影響患者術(shù)后療效的相關(guān)影響因素進(jìn)行分析。

1 資料和方法

1.1 病例資料

選取158例術(shù)前疑似甲狀腺癌患者作為研究對象，并以128名健康體檢者作為對照。158例術(shù)前疑似患者中共有98例患者根據(jù)病理學(xué)檢查結(jié)果確診為甲狀腺癌，其余60例為良性甲狀腺結(jié)節(jié)。惡性組女性58例，男性40例；年齡32～72歲，平均（48.58±5.36）歲；良性組女性36例，男性24例；年齡31～74歲，平均（48.36±5.65）歲；對照組女性70例，男性58例；年齡35～74歲，平均（49.05±5.54）歲。對惡性組患者進(jìn)行清甲治療后，根據(jù)全身碘掃描結(jié)果分為清甲成功組（58例）和未成功組（40例），并根據(jù)患者是否發(fā)生轉(zhuǎn)移分為轉(zhuǎn)移陽性組20例和轉(zhuǎn)移陰性組78例。各組患者年齡和性別等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有惡性組患者均符合甲狀腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，并接受甲狀腺手術(shù)切除且于術(shù)后擬行首次131I治療；②良性組患者經(jīng)病理學(xué)檢查屬于良性甲狀腺結(jié)節(jié)；③所有研究對象不存在嚴(yán)重心、肝、肺、腎功能不全的情況；④健康對照組為甲狀腺檢查正常且未合并其他重大疾病者；⑤年齡不小于18周歲；⑥均已簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有橋本甲狀腺炎、甲亢或其他甲狀腺疾病；②臨床資料不完整或未簽署知情同意書。

1.2 臨床資料收集

全面收集所有研究對象的性別、年齡、身高、體重、甲狀腺功能5項(xiàng)、TNM分期、病理學(xué)類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床資料。

1.3 全身碘掃描及首次131I清甲療效判定

所有惡性腫瘤患者口服131I 100 mCi 進(jìn)行治療，1 周后統(tǒng)一使用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層成像/計(jì)算機(jī)體層成像（single photon emission computed tomography/computed tomography，SPECT/CT）進(jìn)行全身碘掃描（德國Siemens公司，型號：SYMBIA型），采集參數(shù)設(shè)置：矩陣256×1 024，采集速度為15 cm/min，能峰364 KeV，放大倍數(shù)1.0。然后進(jìn)行斷層顯像采集，采集參數(shù)設(shè)置：矩陣64×64，能峰364 KeV，窗寬20%，放大倍數(shù)1.0。另外使用同機(jī)進(jìn)行CT定位掃描，掃描區(qū)域?yàn)槔吖令M下腺水平，電壓、電流分別設(shè)置為120 KV、30 mA。最后利用Esoft軟件處理數(shù)據(jù)得到融和圖像，并由2名工作5年以上的副主任醫(yī)師進(jìn)行閱片，得出掃描結(jié)論。

⑴ 第一次清甲成功標(biāo)準(zhǔn)［6］：首次131I清甲治療后1周對所有研究對象進(jìn)行全身碘掃描及局部斷層融合顯像檢查，結(jié)果顯示，甲狀腺床部位無殘留或放射性濃聚及甲狀腺組織。

⑵ 淋巴結(jié)及肺轉(zhuǎn)移判斷標(biāo)準(zhǔn)［6］：治療期間，影像學(xué)檢查如B超、CT或正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層顯像（positron emission tomography and computed tomography，PET/CT）提示存在肺、淋巴結(jié)或骨轉(zhuǎn)移和（或）兩次131I全身碘掃描過程中發(fā)現(xiàn)患者肺、淋巴結(jié)或骨等甲狀腺外組織攝取131I。

1.4 血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平測定

分別于治療前和治療1周后于清晨采取空腹靜脈血10 mL，3 000 rpm離心10 min后取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）檢測所有患者血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平。取240 ng/mL MIP-1α凍干粉，按照1∶20比例將其溶解得到120.000、60.000、30.000、15.000、7.500、3.750、1.875及0.000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品，在酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）上檢測492 nm處的吸光度（D）值，測定MIP-1α表達(dá)水平；另稱取S-TK1溶解，制備8 000、4 000、2 000、1 000、500、250、125及0 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品，并在酶標(biāo)儀上檢測450 nm處的D值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述所有操作過程均參照說明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行樣品檢測，繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各因子濃度。

1.5 惡性組和良性組甲狀腺組織中MIP-1α、S-TK1組織化學(xué)染色分析

采用免疫組織化學(xué)染色檢測惡性組和良性組MIP-1α、S-TK1在甲狀腺組織中的表達(dá)情況。將患者所有組織標(biāo)本用10%甲醛溶液進(jìn)行固定及石蠟包埋處理后，4～5 μm切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：先進(jìn)行石蠟切片，然后進(jìn)行脫水，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗，使用3%H2O2于室溫下溫育10 min，放于95 ℃的枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，然后加入羊血清于室溫條件下密封1 h，再加入一抗（兔抗），同時(shí)使用PBS替代一抗作為陰性對照組，4 ℃溫育過夜后使用PBS沖洗，加入二抗（山羊抗兔）并于室溫條件下溫育45 min；再次使用PBS沖洗并使用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色和蘇木精復(fù)染，然后使用0.1%鹽酸乙醇進(jìn)行分化和純化水沖洗；將切片脫水后進(jìn)行透明封固，并在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（400倍），統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞總數(shù)，同時(shí)計(jì)算陽性細(xì)胞率，陽性細(xì)胞率分為4個(gè)等級：陽性細(xì)胞率≤10%為1分，陽性細(xì)胞率10%～50%為2分，陽性細(xì)胞率50%～75%為3分，陽性細(xì)胞率＞75%為4分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用單因素和logistic回歸多因素分析患者術(shù)后的療效影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前各組研究對象血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平比較

相比健康對照組和良性組，惡性組患者M(jìn)IP-1α、S-TK1表達(dá)水平顯著更高，良性組MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平高于健康對照組（P＜0.05，表1）。

表1 術(shù)前各組研究對象血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels in preoperative groups ()

表1 術(shù)前各組研究對象血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels in preoperative groups ()

*:P＜0.05,compared with the healthy control group;#:P＜0.05,compared with the benign group

2.2 惡性組和良性組甲狀腺組織中MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MIP-1α蛋白陽性者染色主要表現(xiàn)為棕黃色顆粒狀，惡性組患者甲狀腺組織中MIP-1α蛋白陽性表達(dá)率（70.41%）顯著高于良性組（18.33%），惡性組組織中S-TK1蛋白陽性表達(dá)率（68.37%）顯著高于良性組（15.00%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖1、2。

圖1 MIP-1α在惡性組和良性組中的免疫組織化學(xué)染色Fig.1 Immunohistochemical staining of MIP-1α in malignant group and benign group

圖2 S-TK1在惡性組和良性組中的免疫組織化學(xué)染色Fig.2 Immunohistochemical staining of S-TK1 in malignant group and benign group

2.3 各組間血清MIP-1α、S-TK1比較

研究結(jié)果顯示，與清甲未成功者相比，術(shù)后第2次131I治療前清甲成功組MIP-1α、S-TK1血清表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01，表2）。兩次全身碘掃描結(jié)果和影像學(xué)檢查結(jié)果顯示，8例患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，12例患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移陽性組患者M(jìn)IP-1α、S-TK1血清表達(dá)水平均顯著高于轉(zhuǎn)移陰性組（P＜0.01，表3）。

表2 術(shù)后兩次131I治療前清甲成功組與未成功組血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels between the successful group and the unsuccessful group before 131I treatment()

表2 術(shù)后兩次131I治療前清甲成功組與未成功組血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels between the successful group and the unsuccessful group before 131I treatment()

表3 術(shù)后兩次131I治療前轉(zhuǎn)移陽性組與轉(zhuǎn)移陰性組血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels between two groups before 131I treatment()

表3 術(shù)后兩次131I治療前轉(zhuǎn)移陽性組與轉(zhuǎn)移陰性組血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of serum MIP-1α and S-TK1 expression levels between two groups before 131I treatment()

2.4 甲狀腺癌患者術(shù)后首次131I清甲療效的影響因素分析

單因素分析結(jié)果表明，病灶最大直徑、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、MIP-1α及S-TK1表達(dá)水平會(huì)明顯影響甲狀腺癌患者術(shù)后首次131I清甲療效（P＜0.05，表4）。

表4 甲狀腺癌患者術(shù)后首次131I清甲療效的影響因素分析Tab.4 Analysis of influencing factors of the first 131I clearing effect in patients with thyroid cancer

2.5 甲狀腺癌患者術(shù)后首次131I清甲療效影響因素的logistic回歸分析

分別以清甲療效（賦值：清甲成功=1，清甲未成功=0）為因變量，將病灶最大直徑、BMI、TSH、MIP-1α及S-TK1表達(dá)水平作為自變量，采用逐步回歸法進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。結(jié)果顯示，病灶最大直徑、TSH、MIP-1α及S-TK1表達(dá)水平是影響術(shù)后首次清甲療效的獨(dú)立影響因素（P＜0.05，表5），以上獨(dú)立因素分別設(shè)為A、B、C、D、E，得到回歸方程為Logit（P）=2.689+3.256A（病灶最大直徑）-1.859B（BMI）-2.235C（TSH）-3.524D（MIP-1α）-2.658E（S-TK1）。

表5 甲狀腺癌患者術(shù)后首次131I清甲療效影響因素的logistic回歸分析Tab.5 Logistic regression analysis of influencing factors of 131I clearing effect in patients with thyroid cancer

3 討論

臨床上一般認(rèn)為甲狀腺結(jié)節(jié)包括良性病變和惡性病變，惡性甲狀腺結(jié)節(jié)即甲狀腺癌約占甲狀腺結(jié)節(jié)的10%左右，屬于一種常見的人體內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。由于惡性和良性甲狀腺結(jié)節(jié)患者的臨床表現(xiàn)存在一定交叉，故目前臨床上對于惡性和良性甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷和鑒別仍存在一定困難。穿刺活檢作為診斷良惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的金標(biāo)準(zhǔn)，具有準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，但作為一種有創(chuàng)性檢查會(huì)影響患者的依從性和接受程度，因此，研究甲狀腺結(jié)節(jié)患者的血清學(xué)檢查指標(biāo)具有重要的臨床意義［7］。胸苷激酶作為嘧啶代謝過程中的一種關(guān)鍵酶，包括血清胸苷激酶1（serum-thymidine kinase 1，S-TK1）和S-TK2，其中S-TK1主要存在于細(xì)胞S期，具有催化脫氧胸苷轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗?1-磷酸胸苷酸的功能，可以為DNA合成提供重要原料［3］。研究［8］證實(shí)，S-TK1在人體正常細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但在惡性腫瘤患者的血清中高表達(dá)，并且與癌細(xì)胞增殖速度呈顯著正相關(guān)。已有研究［9］報(bào)道，S-TK1在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等惡性腫瘤患者血清內(nèi)的表達(dá)水平顯著升高。MIP-1α是人體內(nèi)的一種重要的趨化因子，可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞在炎癥部位的聚集，同時(shí)可以趨化一些免疫細(xì)胞如自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位。近年來有臨床研究［10］表明，肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者血清中MIP-1α表達(dá)水平顯著高于健康人群（P＜0.05）。有研究［11］顯示，甲狀腺結(jié)節(jié)患者血清MIP-1α水平與患者甲狀腺惡性程度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。本研究通過對比發(fā)現(xiàn)，惡性甲狀腺病變患者M(jìn)IP-1α、S-TK1血清表達(dá)水平顯著高于甲狀腺良性病變患者和健康對照組（P＜0.05）。對惡性病變患者進(jìn)行清甲治療，結(jié)果顯示，術(shù)后兩次131I治療前清甲成功組MIP-1α、S-TK1血清表達(dá)水平均顯著低于清甲未成功組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。經(jīng)過兩次全身碘掃描及影像學(xué)檢查，有20例患者發(fā)生轉(zhuǎn)移（8例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，12例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），轉(zhuǎn)移陽性組患者血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平均顯著高于轉(zhuǎn)移陰性組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。Khan等［12］研究報(bào)道，甲狀腺癌患者血清S-TK1、MIP-1α水平顯著升高，且表達(dá)水平隨著腫瘤分期升高而升高，與本研究結(jié)果具有一致性。這主要是由于S-TKl作為一種在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用的活性激酶，當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生大量增殖和轉(zhuǎn)移時(shí)，細(xì)胞生長、分裂活動(dòng)更加密集，S-TKl表達(dá)水平亦顯著升高［13］。而MIP-1可以趨化單核細(xì)胞和活化巨噬細(xì)胞，釋放出的大量溶菌酶會(huì)使患者免疫功能嚴(yán)重受損，而腫瘤作為正常細(xì)胞發(fā)生惡變后的產(chǎn)物，同時(shí)會(huì)表達(dá)正常細(xì)胞不表達(dá)的一些抗原，機(jī)體免疫系統(tǒng)識別腫瘤抗原后會(huì)將機(jī)體免疫反應(yīng)激活，因此腫瘤作為一種廣義免疫性疾病，惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散后，患者組織中MIP-1α表達(dá)水平也會(huì)相應(yīng)升高［14］。趙江花等［15］研究顯示，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)MIP-1β（CCL4）和MIP-1α等抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，且上述兩種產(chǎn)物在甲狀腺惡性腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于甲狀腺結(jié)節(jié)組織。因此，MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平與甲狀腺患者惡性病變程度呈顯著相關(guān)性，兩者表達(dá)水平可以作為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性病變早期診斷和術(shù)后療效評價(jià)的重要血清學(xué)指標(biāo)。

本研究對其他影響甲狀腺癌患者術(shù)后療效的相關(guān)因素進(jìn)行分析，單因素分析結(jié)果表明，病灶最大直徑、BMI、TSH、MIP-1α及S-TK1表達(dá)水平會(huì)明顯影響甲狀腺癌患者術(shù)后首次131I清甲療效（P＜0.05）。多因素分析顯示，TSH水平、病灶最大直徑、TSH、MIP-1α及S-TK1是影響術(shù)后首次清甲療效的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。臨床普遍認(rèn)為較高的TSH有助于殘留甲狀腺組織對碘進(jìn)行充分?jǐn)z取，本研究中60～90 μU/mL TSH的患者具有最高的清甲成功率，可能是因?yàn)門SH過高導(dǎo)致TSH受體飽和，從而進(jìn)一步影響碘攝取作用的限制程度。本研究發(fā)現(xiàn)，較大病灶的最大直徑清甲療效更佳，主要是由于病灶最大直徑≤1 cm的甲狀腺乳頭狀微小癌一般發(fā)展非常緩慢且危害很小，因此，甲狀腺切除手術(shù)時(shí)清掃程度和清掃范圍也相應(yīng)縮小，相對殘留的甲狀腺體較多會(huì)進(jìn)一步影響患者清甲成功率［16］。最近有研究［17］顯示，肥胖或高BMI會(huì)增加甲狀腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)并影響甲狀腺癌患者的預(yù)后，可能是因?yàn)橐葝u素樣生長因子1、脂肪因子及TSH等多種激素之間存在相互作用。Parascandolo等［18］研究報(bào)道，BMI增加會(huì)導(dǎo)致TSH升高和總?cè)饧谞钕僭彼崴较陆担瑥亩せ頲AMP/PI3K及RAS-BRAF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生快速增殖。宋韞韜等［19］研究表明，BMI越高，患者的腫瘤病灶范圍一般越廣，因此更容易出現(xiàn)腺外侵犯，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤分期升高。

綜上所述，甲狀腺癌患者血清MIP-1α、S-TK1表達(dá)水平顯著高于健康人群，且病灶最大直徑、TSH、MIP-1α及S-TK1表達(dá)水平是影響術(shù)后首次清甲療效的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），MIP-1α及S-TK1表達(dá)水平與甲狀腺癌患者術(shù)后療效及是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。