孫向明，胡 揚，溫 靜，宋 輝，李文蘭，丁振鐸

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

吳茱萸是傳統(tǒng)的溫里中藥，用于散寒止痛，助陽止瀉，降逆止嘔。據(jù)文獻[1-2]報道，其主要的化學(xué)成分為生物堿、苦味素、揮發(fā)油和黃酮等。現(xiàn)代藥理研究表明[3-7]，吳茱萸主要活性成分具有抗腫瘤、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、保護胃黏膜、血管舒張、強心等作用。隨著對吳茱萸藥理作用和臨床研究的不斷深入，其肝毒性的相關(guān)研究受到廣泛關(guān)注[8-11]。對于傳統(tǒng)口服給藥方式的中藥，發(fā)揮作用的直接物質(zhì)都存在于體內(nèi)，受到胃腸道微生物、酸堿性、代謝酶等的影響，常會使其化學(xué)成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，體內(nèi)不僅有原型成分，也可能存在代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)都有可能是其發(fā)揮藥效或毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

在本課題組前期研究中，已經(jīng)證實吳茱萸的50%乙醇提取物是致肝毒性部位[12]，并揭示了其在大鼠血清中的代謝情況[13]。然而，中藥的體內(nèi)代謝往往是多途徑的，對中藥成分的體內(nèi)代謝行為進行多樣性分析，有助于深入了解中藥原型成分和代謝產(chǎn)物之間的質(zhì)變代謝規(guī)律和體內(nèi)作用過程。

本研究擬采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)技術(shù)全面表征吳茱萸肝毒性部位經(jīng)灌胃進入大鼠膽汁、尿液、糞便中的成分，通過分析大鼠體內(nèi)運載的吳茱萸代謝產(chǎn)物信息，逆向追蹤原型成分，推測各代謝產(chǎn)物可能的代謝途徑。通過進一步比較原型成分及代謝產(chǎn)物在不同生物樣品中的分布情況，以期全面分析吳茱萸在體內(nèi)的代謝和排泄過程，為闡明肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考和佐證。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

ACQUITY UPLC I-Class液相系統(tǒng)、Xevo G2-S QTOF質(zhì)譜系統(tǒng)、UNIFI 1.7軟件：美國Waters公司產(chǎn)品；Allegra 64R低溫高速離心機：美國貝克曼庫爾有限公司產(chǎn)品。

1.2 試劑與材料

吳茱萸：購自哈爾濱三棵樹藥材市場，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)張德連教授鑒定為吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.；ProElut PLS 固相萃取小柱(60 mg，3 mL)：北京迪科馬科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈和甲酸：色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

雄性Wistar大鼠(合格證號SCXK-(吉))：質(zhì)量為(230±20) g，購自長春國家生物產(chǎn)業(yè)基地實驗動物中心。單次實驗所用的大鼠均為同一批次，自由進食飲水，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.3 灌胃藥液的制備與給藥

取適量吳茱萸粗粉，用50%乙醇浸泡過夜，熱回流法提取2次，分別為8倍量溶劑提取120 min、7倍量溶劑提取90 min，將2次提取液減壓濃縮至無醇味呈浸膏狀，給藥前以蒸餾水制成約1.4 g生藥材/mL的灌胃藥液。

將大鼠分為給藥組和空白組，每組6只。給藥前稱取大鼠體重，按照35 g/(kg·d)(以生藥計)的劑量灌胃給藥，每天1次，空白組每天給予25 mL/kg蒸餾水，連續(xù)給藥14天(本課題組的前期實驗證實連續(xù)灌胃14天可致大鼠出現(xiàn)肝毒性[12])。

1.4 生物樣品的采集和預(yù)處理

1.4.1生物樣品的采集 于第13天給藥后將大鼠放回代謝籠中，禁食不禁水，收集0～24 h內(nèi)的尿液和糞便。末次給藥后立即用10%水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉，打開腹腔，在十二指腸的腸系膜上找到具有韌性的白色膽管，用聚氯乙烯管向肝臟方向穿入，醫(yī)用縫合線進行線結(jié)扎固定，收集4 h內(nèi)流出的膽汁。整個實驗過程中，用生理鹽水紗布覆蓋創(chuàng)面，并保持濕潤。

1.4.2生物樣品的預(yù)處理 分別取3 mL含藥和空白膽汁樣品，加入12 mL甲醇，于離心管中充分渦旋混勻1 min，再以12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，氮氣吹干。

將空白及含藥尿液以3 000 r/min離心15 min，分別取3 mL離心后上清液活化平衡后的固相萃取小柱。先用蒸餾水淋洗，洗去強極性的雜質(zhì)，棄去淋洗液；再分別用3 mL 50%甲醇、乙腈洗脫，收集、合并洗脫液，氮氣吹干。

分別稱取1 g搗碎后的含藥和空白糞便樣品，加入9 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，做勻漿處理。再用水飽和正丁醇萃取3次，每次加入10 mL，收集萃出液，以3 000 r/min離心15 min，取上清液減壓濃縮后，氮氣吹干。在進行UPLC-Q-TOF MS分析前，用0.5 mL 50%甲醇充分溶解上述生物樣品的氮吹殘留物，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除去雜質(zhì)。

1.5 實驗條件

色譜和質(zhì)譜分析條件與參考文獻[13]一致。采用HSS T3色譜柱(1.8 μm×100 mm×2.1 mm)；流動相：0.1%甲酸-水(A)，0.1%甲酸-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～0.3 min(1%B)，0.3～2 min(1%～15%B)，2～4 min(15%～25%B)，4～6 min(25%～55%B)，6～8 min(55%～70%B)，8～12 min(70%～99%B)；流速：0.5 mL/min。采用大氣壓電噴霧離子掃描；毛細管電壓：2.5 kV；源溫度：120 ℃；霧化氣溫度：500 ℃；霧化氣流速：800 L/h；錐孔氣流速：10 L/h；采集模式：MSE；采集質(zhì)量范圍：m/z50～1 200；低碰撞能量：4.0 eV；高碰撞能量：20.0～45.0 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 大鼠膽汁、尿液和糞便中吳茱萸原型成分分析

采用UPLC-Q-TOF MS技術(shù)對灌胃吳茱萸肝毒性部位后的大鼠體內(nèi)樣品進行正、負離子模式掃描，比較樣品的基峰離子(BPI)色譜圖，結(jié)果表明，在正離子模式下信號響應(yīng)更強，因此選取正離子模式進行分析。

空白膽汁與含藥膽汁、空白尿液與含藥尿液、空白糞便與含藥糞便的BPI色譜圖示于圖1，共檢測到10個排入膽汁的成分，20個進入尿液的成分，26個進入糞便的成分。進一步與吳茱萸肝毒性部位各化學(xué)成分的保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)[13]比對，發(fā)現(xiàn)膽汁中4個成分為原型成分(1～4號峰)，尿液中15個成分為原型成分(2～16號峰)，糞便中22個成分為原型成分(1～5、7～23號峰)，結(jié)果列于表1。有關(guān)原型成分的解析過程已在文獻[13]中做了詳細闡述，本文不再贅述。

注：a～j峰為代謝產(chǎn)物峰，1～23為原型成分峰圖1 含藥膽汁與空白膽汁(a)，含藥尿液與空白尿液(b)，含藥糞便與和空白糞便(c)的基峰離子色譜圖Fig.1 Base-peak ion chromatograms of medicated bile and blank bile (a), medicated urine and blank urine (b), medicated feces and blank feces (c)

2.2 大鼠膽汁、尿液和糞便中吳茱萸的代謝產(chǎn)物分析

由圖1和表2可見，在膽汁中檢測到6個代謝產(chǎn)物(a～f號峰)，在尿液中檢測到5個代謝產(chǎn)物(a,c,e,g,h號峰)，在糞便中檢測到4個代謝產(chǎn)物(b,c,i,j號峰)。其中，代謝產(chǎn)物b、c、e、h、j也是吳茱萸肝毒性部位在血中的代謝產(chǎn)物，分別對應(yīng)喹諾酮類生物堿代謝物Ⅰ、羥基去氫吳茱萸堿、去甲基去氫吳茱萸堿、羥基吳茱萸堿和14-甲?；鋮擒镙谴螇A[13]。由于代謝物b的結(jié)構(gòu)未知，但其二級碎片離子m/z173.083 9、186.091 6是喹諾酮類生物堿的特征碎片離子[14]，提示其為喹諾酮類生物堿，但因缺乏相關(guān)文獻報道，故在本文中將其暫定為

喹諾酮類生物堿代謝物Ⅰ。利用UNIFI 1.7軟件數(shù)據(jù)庫比對與人工解析相結(jié)合，進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，參考化合物的裂解規(guī)律、各級質(zhì)譜信息和已有文獻報道對其他代謝物進行結(jié)構(gòu)解析[15-20]：代謝物a的[M+H]+峰為m/z494.156 3，推斷其分子式為C25H23N3O8，誤差為0.01×10-6。碎片離子m/z318.124 2與母離子相差176.032 1 u，為母離子失去1分子葡萄糖醛酸(GlcA)產(chǎn)生的[M+H-C6H8O6]+，同時出現(xiàn)丟失葡萄糖醛酸苷(OGlcA)產(chǎn)生的m/z302.100 1碎片離子，因此推測代謝物a為去氫吳茱萸堿葡糖醛酸結(jié)合物。代謝物d的[M+H]+峰為m/z274.144 2，代謝物i的[M+H]+峰為m/z302.175 9，二者的碎片離子中都包含m/z173、186等喹諾酮類生物堿的特征碎片離子，由于結(jié)構(gòu)未知，缺乏相關(guān)文獻報道，分別暫定為喹諾酮類生物堿代謝物Ⅱ和喹諾酮類生物堿代謝物Ⅲ。代謝物f的[M+H]+峰為m/z520.339 8，有碎片離子m/z184.073 8、104.107 4，其結(jié)構(gòu)未知。代謝物g的[M+H]+峰為m/z398.320 4，推斷其分子式為C19H15N3O5S，誤差為2.26×10-6，碎片離子m/z318.124 4與母離子相差80.195 7 u，為母離子丟失1分子磺酸基(SO3)產(chǎn)生的[M+H-SO3]+，碎片離子m/z302.129 1與母離子相差96.191 3 u，為母離子失去1分子硫酸基(SO4)形成的[M+H-SO4]+，推測g為去氫吳茱萸堿硫酸結(jié)合物。各代謝產(chǎn)物的二級質(zhì)譜圖示于圖2。

2.3 代謝產(chǎn)物的代謝途徑分析

本研究在大鼠的膽汁、尿液和糞便樣品中共檢測出10個代謝產(chǎn)物，其中4個代謝物結(jié)構(gòu)未得到鑒定，6個代謝產(chǎn)物推測由4個原型成分通過葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化、甲?；娶蛳啻x以及羥基化、去甲基化等Ⅰ相代謝途徑轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，具體的代謝途徑示于圖3[15-16,18]。推測代謝物a(去氫吳茱萸堿葡糖醛酸結(jié)合物)、代謝物c(羥基去氫吳茱萸堿)、代謝物e(去甲基去氫吳茱萸堿)、代謝物g(去氫吳茱萸堿硫酸結(jié)合物)分別是由原型成分去氫吳茱萸堿與體內(nèi)葡萄糖醛酸結(jié)合、發(fā)生羥基化、脫甲基反應(yīng)、與體內(nèi)硫酸基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物；代謝物h(羥基吳茱萸堿)可能為羥基吳茱萸堿在體內(nèi)發(fā)生羥基化的代謝產(chǎn)物；代謝物j(14-甲?；鋮擒镙谴螇A)可能為二氫吳茱萸次堿在體內(nèi)發(fā)生甲?；蟮拇x產(chǎn)物。

2.4 血清、膽汁、尿液、糞便中吳茱萸肝毒性部位的代謝比較

結(jié)合吳茱萸肝毒性部位入血成分分析結(jié)果[13]，比較吳茱萸肝毒性部位的原型成分和代謝產(chǎn)物在不同生物樣品中的分布情況和代謝途徑，有助于了解藥物的體內(nèi)作用過程和代謝規(guī)律。

注：a.去氫吳茱萸堿葡糖醛酸結(jié)合物；b.羥基去氫吳茱萸堿；c.去甲基去氫吳茱萸堿；d.去氫吳茱萸堿硫酸結(jié)合物；e.羥基吳茱萸堿；f.14-甲?；鋮擒镙谴螇A圖2 代謝產(chǎn)物的二級質(zhì)譜圖Fig.2 Secondary mass spectra of metabolites

圖3 吳茱萸肝毒性部位在大鼠膽汁、尿液和糞便中的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of Euodiae Fructus hepatotoxic part in rat bile, urine and feces

吳茱萸的主要成分類型為生物堿類，極性較小，易以原型物形式被直接吸收。在大鼠體內(nèi)共檢測到23個吳茱萸肝毒性部位的原型成分，且多數(shù)成分的排泄途徑呈多樣性。就原型藥物而言，腎排泄是主要消除途徑，有些藥物具有肝腸循環(huán)的特點，其代謝物經(jīng)膽汁進入小腸，釋放出原型藥物，最終通過糞便排出。在血清中發(fā)現(xiàn)的15個原型成分會同時在尿液、膽汁或糞便中被檢測到，推測這些原型成分經(jīng)胃腸道被吸收入血后，通過肝門靜脈進入肝臟，一部分進入體循環(huán)，最終隨尿液排出體外，成為血清和尿液樣品的共有成分，一部分被排泄到膽汁，經(jīng)膽管到達小腸，直接由糞便排出，因此血清、膽汁、糞便中均能檢出；一些成分未被完全吸收，則隨腸道糞便排出，可在血清和糞便中同時檢測到。另外，有7個原型成分未在血清中檢測到，其中一個原因可能是由于藥物含量甚微，現(xiàn)有的條件無法檢測到，而尿液和糞便是累計收集24 h的樣品，藥物濃度一般高于血中，故在尿液和糞便中可以被檢測到；另一個原因可能是該原型成分未被吸收入血，直接經(jīng)腸道隨糞便排出體外。

在大鼠的4種生物樣品中共檢測到12個代謝產(chǎn)物，其中4個成分結(jié)構(gòu)未知。吳茱萸的代謝途徑多樣，在血清、尿液、糞便和膽汁中均能發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物，且Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝均會發(fā)生。去氫吳茱萸堿在大鼠體內(nèi)發(fā)生了葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化、羥基化和去甲基化等多種代謝反應(yīng)，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物主要出現(xiàn)在膽汁和尿液樣品中，可能以肝代謝為主，代謝產(chǎn)物極性增加，水溶性增強，主要排泄途徑為腎和膽排泄。一般情況下，膽汁排泄是藥物代謝物尤其是水溶性大的代謝物的主要排泄途徑，分子質(zhì)量<300的化合物從尿液排泄，分子質(zhì)量300～500的化合物從膽汁和尿液排泄，分子質(zhì)量大于500的化合物主要從膽汁排泄。此外，某些藥物的膽汁排泄具有肝腸循環(huán)現(xiàn)象，膽汁分泌后又被小腸重新吸收，或者代謝物被分泌入膽汁，然后又在小腸轉(zhuǎn)化為藥物被重新吸收。在本研究中，以去氫吳茱萸堿葡糖醛酸結(jié)合物為例，分子質(zhì)量為493，由表2可知，其主要排泄途徑是尿液和膽汁，而且很可能自膽汁流入腸腔，在腸道菌群或酶的作用下轉(zhuǎn)化為去氫吳茱萸堿原型，部分被小腸重新吸收入血進入體循環(huán)，呈現(xiàn)肝腸循環(huán)現(xiàn)象，部分隨糞便排出。在糞便樣品中也檢測到了去氫吳茱萸堿原型，并且在另一項研究中，通過繪制去氫吳茱萸堿的“血藥濃度-時間”擬合曲線，發(fā)現(xiàn)去氫吳茱萸堿出現(xiàn)了明顯的雙峰，進一步印證了上述推測。在血清和糞便樣品中，同時檢測到14-甲?；鋮擒镙谴螇A，推測為原型成分二氫吳茱萸次堿水解和甲?；a(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，該原型成分在血清和糞便中均被檢測到，推測一部分原型成分被直接吸收入血，另一部分原型成分在腸道內(nèi)發(fā)生代謝，代謝產(chǎn)物入血，并通過膽汁排泄，進入腸道后隨糞便排出。吳茱萸次堿發(fā)生羥基化反應(yīng)，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物羥基吳茱萸次堿，僅在血清中被檢測到，推測入血后在體內(nèi)被進一步代謝，以其他代謝產(chǎn)物形式排泄。吳茱萸堿在體內(nèi)發(fā)生羥基化反應(yīng)，在血清和尿液中可檢測到其代謝產(chǎn)物羥基吳茱萸堿，推測尿液是其唯一的排泄途徑。

對于口服藥物毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，進入血液中的原型成分和代謝產(chǎn)物是研究重點，在血清、膽汁、尿液、糞便中共存的成分更有研究意義[21-23]。目前，對中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定，往往局限于有文獻報道和先驗知識的代謝產(chǎn)物，且僅通過色譜和質(zhì)譜手段進行分析，結(jié)果的可靠性有待驗證，還需要在未來的研究中以核磁共振等方法對有意義的代謝物進行驗證，得到確切結(jié)論。

3 結(jié)論

本文應(yīng)用UPLC-Q-TOF MS/MS技術(shù)對灌胃吳茱萸肝毒性部位后進入大鼠膽汁、尿液、糞便中的吳茱萸原型成分及代謝產(chǎn)物進行全面的定性分析及代謝途徑解析。在膽汁中檢測到4個原型成分和6個代謝產(chǎn)物；在尿液中檢測到15個原型成分和5個代謝產(chǎn)物；在糞便中檢測到22個原型成分和4個代謝產(chǎn)物。在對代謝產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)表征的基礎(chǔ)上，進一步推測了吳茱萸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑，包括葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸酯化、甲?；⒘u基化、去甲基化、水解等，并通過比較原型成分和代謝產(chǎn)物在不同生物樣本中的分布情況，進一步探索其體內(nèi)的作用過程，為吳茱萸的肝毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及代謝規(guī)律研究提供了參考依據(jù)。