李運運，何 晨，吳建勛，張亞和，梁詠梅，史 權(quán),，張傳倫

(1.中國石油大學(xué)(北京)重質(zhì)油國家重點實驗室，北京 102249；2.深圳海洋地球古菌組學(xué)重點實驗室，南方科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程系，廣州 深圳 518055)

甘油二烷基甘油四醚(glycerol dialkyl glycerol tetraethers, GDGTs)作為古菌和細(xì)菌的大分子生物標(biāo)志物，是兩者細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成，廣泛分布于各類自然環(huán)境中[1]。GDGTs主要包括源自古菌的類異戊二烯型甘油二烷基甘油四醚類化合物(isoprenoid GDGTs, iso-GDGTs)和源自細(xì)菌的支鏈型甘油二烷基甘油四醚類化合物(branched GDGTs, br-GDGTs)，是由2條烷基側(cè)鏈通過醚鍵與兩端的甘油基團形成的環(huán)狀大分子[2]，結(jié)構(gòu)式示于圖1。GDGTs的分子組成分布及分子結(jié)構(gòu)變化對其源微生物生存環(huán)境變化響應(yīng)敏感，包含豐富的古環(huán)境信息，已廣泛應(yīng)用于構(gòu)建一系列GDGTs古環(huán)境替代指標(biāo)[3]，如陸源輸入指標(biāo)(branched vs isoprenoid tetrether, BIT)用于重建土壤有機質(zhì)輸入[4]、基于86個碳原子四醚指數(shù)的古溫度計指標(biāo)(TetraEther indeX of 86 carbon atoms, TEX86)用于重建表層海水溫度[5]、甲基化指數(shù)(methylation index of branched tetraethers, MBT)與環(huán)化指數(shù)(cyclisation ratio of branched tetraethers, CBT)之比(MBT/CBT)反映陸地年均大氣溫度以及土壤pH值變化[6]等。對GDGTs分子組成的全面詳細(xì)表征，可為古環(huán)境指標(biāo)提供更全面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐[7-11]。

GDGTs化合物相對分子質(zhì)量較大，通常分布于1 000～1 400之間。古菌烷基的側(cè)鏈類型以類異戊二烯烷烴為主，細(xì)菌烷基的側(cè)鏈類型以支鏈型烷烴為主。環(huán)境對烷基側(cè)鏈的修飾主要包括羥基化、環(huán)化、不飽和化及甲基化，導(dǎo)致不同GDGTs分子的烷基側(cè)鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，這為GDGTs的分子組成分析和結(jié)構(gòu)表征帶來很大挑戰(zhàn)。質(zhì)譜分析方法已廣泛應(yīng)用于GDGTs的組成研究，如飛行時間質(zhì)譜(time-of-flight-mass spectrometry, TOF-MS)、高溫氣相色譜-串聯(lián)火焰離子化檢測法/質(zhì)譜法(high temperature gas chromatography-flame ionisation detection/mass spectrometry, HTGC-FID/MS)[12]以及高效液相色譜-串聯(lián)大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry, HPLC-APCI-MS)[2]等。HPLC-APCI-MS采用選擇離子監(jiān)測模式(selected ion monitoring mode, SIM)對已知GDGTs進行靶向分析，是生物地球化學(xué)研究應(yīng)用最廣泛的分析方法，極大推進了GDGTs在環(huán)境化學(xué)和地球化學(xué)領(lǐng)域的研究[13-15]。然而，該方法無法分析具有潛在地球化學(xué)意義的未知GDGTs分子，且在SIM模式應(yīng)用過程中常使用四極桿質(zhì)譜作為檢測器，其低分辨檢測能力會導(dǎo)致iso-GDGTs和br-GDGTs產(chǎn)生不同程度的離子強度損失，最高可達36%，嚴(yán)重影響了古環(huán)境指標(biāo)的準(zhǔn)確性[16]。此外，該方法的樣品前處理過程繁瑣、回收率不高，一些相對含量較低的GDGTs可能無法被檢測[9,17]。鑒于GDGTs在地球化學(xué)和環(huán)境化學(xué)領(lǐng)域中的重要性日益顯著，迫切需要一種高效、全面分析環(huán)境樣品中GDGTs分子組成和分子結(jié)構(gòu)信息的方法[18]。

注：a.iso-GDGTs；b.br-GDGTs圖1 地質(zhì)體中常見的GDGT類化合物結(jié)構(gòu)示意圖[9]Fig.1 Structures of GDGTs commonly found in geological environment

大氣壓光致電離正離子模式耦合傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(atmospheric pressure photoionization in positive mode coupled to fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, APPI-P FT-ICR MS)在GDGTs分子組成分析方面取得了一些新進展[19]。APPI電離源對GDGTs的電離效果較常用的APCI電離源更溫和。使用APPI分析GDGTs時，溶劑甲苯促進質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)和電荷交換，形成準(zhǔn)分子離子[M+H]+，使其在GDGTs分子信息表征上具有巨大潛力。雖然FT-ICR MS已經(jīng)成功應(yīng)用于GDGTs分子組成表征，但高昂的儀器成本和維護費用大大限制了其廣泛應(yīng)用[19]。高分辨軌道離子阱質(zhì)譜(Orbitrap MS)可提供約250 000(@m/z400)的分辨能力，能夠滿足鑒定海洋沉積物中GDGTs分子組成的要求；并且Orbitrap MS可與HPLC串聯(lián)分析GDGTs，在地球化學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力。

本研究擬以海洋沉積物為研究對象，使用APPI-P Orbitrap MS分析GDGTs的組成與結(jié)構(gòu)?；贠rbitrap MS的超高分辨能力，以獲得準(zhǔn)確的GDGTs分子組成和豐富的串聯(lián)質(zhì)譜碎片離子信息，從而實現(xiàn)對GDGTs分子組成和分子結(jié)構(gòu)的高效全面表征。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Thermo Fisher Orbitrap FusionTMTribridTM高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，配有大氣壓光致電離源、Xcalibur 3.0工作站；電子分析天平(ME204E)：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；TDL-5A臺式離心機：億能實驗儀器廠產(chǎn)品；FD-1C-50真空冷凍干燥機：上海比朗儀器制造有限公司產(chǎn)品。將錐形瓶、移液瓶等玻璃儀器洗滌干凈，放入烘箱內(nèi)烘干，然后放入馬弗爐內(nèi)在500 ℃下烘燒5 h，除去有機、無機離子雜質(zhì)。

1.2 試劑與樣品

甲苯、二氯甲烷、甲醇，所用有機試劑均為LC-MS級，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3 樣品制備

沉積物樣品為珠江口海底表層沉積物，采樣地點為113° 43′ 21.25″ E、22° 38′ 5.07″ N，采樣深度0～5 cm。冷凍保存的沉積物樣品經(jīng)冷凍干燥48 h，以除去其中水分，得到完全干燥的母樣，將其置于瑪瑙研缽中研磨30 min，稱量約20 g研磨后的樣品，放入濾紙袋中封好，置于索氏抽提管中。使用DCM-MeOH混合溶劑(9∶1，V/V)在55 ℃下回流抽提樣品24 h，充分抽提出沉積物中的脂類化合物。抽提后的總脂過0.45 μm玻璃纖維濾膜，以除去其中的顆粒雜質(zhì)，將溶劑旋蒸后，用甲苯復(fù)溶并置于-20 ℃冰箱中保存。

1.4 實驗條件

大氣壓光致電離源，正離子模式；毛細(xì)管溫度200 ℃；噴霧電壓3 000 V；鞘氣(N2)流速25 Arb；掃氣(N2)流速2 Arb；輔助氣(N2)流速5 Arb；離子輸送管溫度320 ℃；采用全掃描模式采集數(shù)據(jù)；質(zhì)量掃描范圍m/z1 000～1 600；二級質(zhì)譜隔離寬度為1 u；高能碰撞解離(HCD)碰撞能量相對強度20%。

2 結(jié)果與分析

2.1 GDGTs分子組成分析

使用APPI-P Orbitrap MS檢測到沉積物中GDGTs分子組成及分布范圍信息，示于圖2。沉積物抽提物APPI-P質(zhì)譜圖示于圖2a，主要由分布于m/z1 000～1 100的br-GDGTs和分布于m/z1 250～1 350的iso-GDGTs組成，依據(jù)Orbitrap MS提供的精確質(zhì)荷比，結(jié)合質(zhì)子化分子離子及其同位素峰相對豐度，對圖2a中的br-GDGTs和iso-GDGTs進行鑒定，共鑒定到14種GDGTs，分別為br-GDGT Ia、br-GDGT Ib、br-GDGT Ic、br-GDGT IIc、br-GDGT IIb、br-GDGT IIa、br-GDGT IIIb、br-GDGT IIIa、GDGT-0、GDGT-1、GDGT-2、GDGT-3、crenarchaeol和GDGT-6，列于表1，平均分辨率約15萬，測量誤差在±1×10-6之內(nèi)。

圖2 沉積物提取物br-GDGT Ib及其13C同位素準(zhǔn)分子離子分布圖Fig.2 Mass spectra of br-GDGT Ib and its 13C isotopologs in sediment extracts

表1 GDGTs分子組成信息Table 1 Molecular composition of GDGTs

續(xù)表1

m/z1 019.5～1 022.5的局部放大譜圖示于圖2b，br-GDGT Ib的實測質(zhì)譜峰與理論同位素質(zhì)譜峰的相對強度及分布對應(yīng)良好。值得注意的是，br-GDGT Ib的同位素峰[13C2C64H130O6+H]+的理論相對分子質(zhì)量為1 022.000 740 u，與br-GDGT Ia的[C66H132O6+H]+理論相對分子質(zhì)量僅相差0.008 928 u。m/z1 021.85～1 022.15的局部放大譜圖示于圖2c，br-GDGT Ib的同位素分子離子峰與br-GDGT Ia的質(zhì)子化分子離子峰成功分離，表明Orbitrap MS提供的超高質(zhì)量分辨率可以滿足GDGTs分子的直接分析需求。但實測的br-GDGT Ib同位素峰[13C2C64H130O6+H]+相對豐度低于理論同位素質(zhì)譜峰，這可能是由于儀器調(diào)諧等因素導(dǎo)致的。

依據(jù)APPI-P Orbitrap MS出色的高分辨能力，實現(xiàn)了對沉積物中GDGTs分子精準(zhǔn)的非靶向定性分析，可全面分析所有潛在的GDGTs分子，表征GDGTs分子組成分布及相對豐度信息。

2.2 串聯(lián)質(zhì)譜表征GDGTs分子結(jié)構(gòu)

通過APPI-P Orbitrap MS/MS對crenarchaeol、GDGT-0和br-GDGT Ia這3類具有代表性結(jié)構(gòu)的GDGTs類化合物在梯度碰撞能量下進行隔離碎裂檢測，結(jié)果示于圖3。GDGT-0和crenarchaeol源自古菌，均具有雙植烷型側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，區(qū)別在于前者烷基側(cè)鏈上無環(huán)狀結(jié)構(gòu)，后者烷基側(cè)鏈分別具有2和3個環(huán)結(jié)構(gòu)。由圖3可見，當(dāng)HCD相對能量為0%，僅對離子實施隔離而不提供碰撞能量，成功實現(xiàn)了GDGTs的準(zhǔn)分子離子峰的單獨隔離檢測；隨著HCD相對能量增大至15%，母離子出現(xiàn)輕微碎裂，m/z600～800范圍內(nèi)出現(xiàn)碎片離子簇，為目標(biāo)離子丟失18 u(H2O) 和74 u(C3H6O2)形成的碎片離子峰；當(dāng)HCD相對能量為20%時，碎片離子相對強度超過母離子，觀察到碎片離子的數(shù)目最全、種類最多；當(dāng)HCD相對能量增大至25%，m/z600～800范圍內(nèi)的碎片離子簇進一步碎裂成為更小質(zhì)量的碎片離子簇(

在APPI-P Orbitrap MS/MS檢測模式下，化合物crenarchaeol、GDGT-0和br-GDGT Ia經(jīng)不同的碎裂方式生成一系列碎片離子，三類GDGTs均產(chǎn)生脫H2O和脫C3H6O2的碎片離子峰，對應(yīng)GDGTs分子結(jié)構(gòu)中的羥基基團和甘油基團。每類GDGT分子在多級裂解過程中均產(chǎn)生多個系列的特征性碎片離子簇，br-GDGT Ia共檢測到51種烴鏈碎片離子，44種含氧碎片離子；crenarchaeol共檢測到36種烴鏈碎片離子，31種含氧碎片離子；GDGT-0共檢測到34種烴鏈碎片離子，20種含氧碎片離子，主要碎片離子信息列于表2。

每個GDGT分子均有多種碎裂方式，通過對碎片離子進行強度篩選，將相對豐度較高的碎片離子的碎裂方式作為該GDGT分子的特征碎裂途徑。以br-GDGT Ia為例，第一種途徑A是[C66H132O6+H]+甘油基團的烷基側(cè)鏈發(fā)生碎裂，形成[C33H64O2+H]+和[C33H68O4+H]+，示于圖4a；另一種途徑B是[C66H132O6+H]+的烷基側(cè)鏈發(fā)生碎裂，形成[C30H56+H]+和[C36H74O6+H]+，并進一步以丟失H2O中性基團的方式失去含氧官能團，生成系列碎片離子。在GDGT-0的檢測結(jié)果中，觀察到相似的特征碎片離子簇，GDGT-0與br-GDGT Ia具有相似的分子平均結(jié)構(gòu)，[C86H172O6+H]+經(jīng)碎裂丟失烷基側(cè)鏈[C40H72]形成[C40H72+H]+和[C46H94O6+H]+，另一種途徑則是丟失[C43H84O2]形成[C43H88O4+H]+、[C43H84O2+H]+等含氧碎片離子，示于圖4b。

圖3 APPI-P Orbitrap MS/MS HCD模式下，crenarchaeol、GDGT-0與br-GDGT Ia串聯(lián)質(zhì)譜圖隨HCD相對能量變化Fig.3 Mass spectra of crenarchaeol, GDGT-0 and br-GDGT Ia with various of HCD energy in APPI-P Orbitrap MS/MS HCD mode

表2 GDGTs主要碎片離子信息Table 2 Dominant fragment ions of GDGTs

圖4 br-GDGT Ia (a)、GDGT-0(b)和crenarchaeol(c)的APPI-P Orbitrap MS/MS質(zhì)譜圖和特征碎裂示意圖Fig.4 Mass spectra and fragmentation pathways of br-GDGT Ia (a), GDGT-0 (b) and crenarchaeol (c) by APPI-P Orbitrap MS/MS

Crenarchaeol的分子結(jié)構(gòu)與br-GDGT Ia、GDGT-0不同，分子中存在含環(huán)狀結(jié)構(gòu)的烷基側(cè)鏈，且不同側(cè)鏈所含環(huán)數(shù)不同，[C86H162O6+H]+以途徑A、B 2種烷基側(cè)鏈碎裂的方式可分別生成[C46H88O6+H]+和[C46H90O6+H]+2個系列的碎片離子簇，示于圖4c。

使用APPI-P Orbitrap MS/MS對crenarchaeol、GDGT-0和br-GDGT Ia的分析結(jié)果表明，不同GDGT分子經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析所獲得的碎片離子簇的碳數(shù)-DBE分布圖特征性地反映了其分子結(jié)構(gòu)信息。以crenarchaeol為例，APPI-POrbitrap MS/MS質(zhì)譜圖提供的結(jié)構(gòu)組成信息示于圖5，其中低分子質(zhì)量烷烴側(cè)鏈碎片離子反映了GDGTs分子結(jié)構(gòu)的烷烴側(cè)鏈信息，在400～500 u范圍內(nèi)，含有3個環(huán)的烷烴側(cè)鏈形成的碎片離子占主導(dǎo)地位，隨著亞甲基斷裂，單質(zhì)量點上烷烴側(cè)鏈碎片離子簇DBE分布情況并未發(fā)生變化；在200～400 u和100～200 u范圍內(nèi)，隨著碎片離子相對質(zhì)量減小，碎裂程度加深，烴鏈上的開環(huán)過程導(dǎo)致占主導(dǎo)地位的碎片離子DBE隨分布區(qū)間下降。碎片離子的DBE碳數(shù)分布圖示于圖5c，其具有良好的規(guī)律性。圖5b中這些由母離子在碰撞過程中形成了種類復(fù)雜、數(shù)量繁多的烴類碎片離子簇的DBE碳數(shù)分布對應(yīng)圖5c中左下角區(qū)域，較好地反映了目標(biāo)GDGTs分子的烷烴側(cè)鏈結(jié)構(gòu)信息，故將其定義為指紋區(qū)碎片離子簇，作為使用串聯(lián)質(zhì)譜表征其母離子分子結(jié)構(gòu)特征的指標(biāo)之一；右上角為crenarchaeol母離子，中間部分為分布特征性較強的含氧碎片離子簇，其不同的DBE分布對應(yīng)不同的碎裂行為，而相同DBE對應(yīng)相對豐度之和則反映該類碎裂行為在整體過程中所占的比重，示于圖5c。對于crenarchaeol，在碎裂過程中主要以4類碎裂形式為主，其中以生成DBE=5的碎裂形式為主要途徑。將這些含氧碎片離子作為特征區(qū)碎片離子簇，可成為使用串聯(lián)質(zhì)譜表征其母離子結(jié)構(gòu)特征的另一指標(biāo)。

注：a.烷基側(cè)鏈碎裂示意圖；b.指紋區(qū)碎片離子簇分布；c.總碎片離子簇DBE碳數(shù)分布圖圖5 APPI-P Orbitrap MS/MS質(zhì)譜圖提供的crenarchaeol結(jié)構(gòu)組成信息Fig.5 Gradient fragmentation spectra of crenarchaeol by APPI-P Orbitrap MS/MS

APPI-P Orbitrap MS不僅可以通過直接分析獲得全面的GDGTs分子組成信息，而且Orbitrap MS具有精確質(zhì)量隔離能力，可對目標(biāo)GDGTs分子進行精確隔離碎裂檢測，表征其分子結(jié)構(gòu)信息。根據(jù)碎片離子簇的種類(是否含氧)和分布規(guī)律，將檢測到的數(shù)百個碎片離子劃分為指紋區(qū)碎片離子簇和特征區(qū)碎片離子簇，二者共同反映了GDGTs分子的烷烴側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和含氧官能團等的結(jié)構(gòu)信息。

需要注意的是，使用Orbitrap MS直接分析GDGTs無法獲得單一GDGT分子的同分異構(gòu)體，且串聯(lián)質(zhì)譜分析獲得的是GDGT的平均分子結(jié)構(gòu)信息，而非單一GDGT分子的結(jié)構(gòu)信息。該方法可為鑒定GDGTs以及其他目前無法區(qū)分的異構(gòu)體提供參考，并且可與高效液相色譜結(jié)合，在GDGTs總脂占比等定量分析方面具有重要潛力。

3 結(jié)論

本研究使用APPI-P Orbitrap MS直接分析海洋沉積物中古菌和細(xì)菌GDGTs化合物的分子組成，并研究了3種不同分子結(jié)構(gòu)的GDGT在串聯(lián)質(zhì)譜正離子模式下的裂解行為。結(jié)果表明，從珠江口海底表層沉積物中檢測到14種GDGTs。相較于傳統(tǒng)的HPLC APCI-MS方法，Orbitrap MS提供的超高分辨率可在復(fù)雜基質(zhì)中直接分析GDGTs化合物，從而縮短了分析時間，提高了分析效率，并且可通過一次分析全面獲得GDGTs分子組成及分布，在鑒定新型GDGT同系物方面具有重要潛力。另外，對分子結(jié)構(gòu)具有代表性的GDGT-0、crenarchaeol和br-GDGT Ia 3個化合物的二級質(zhì)譜進行解析，結(jié)果表明，crenarchaeol的碎片離子簇比GDGT-0具有更特征性的碎裂方式和更豐富的指紋區(qū)烴鏈碎片離子簇，可以有效區(qū)分上述2種具有烷基側(cè)鏈結(jié)構(gòu)差異的同系物。通過解析串聯(lián)質(zhì)譜碎片離子簇，創(chuàng)新性地提出將二級質(zhì)譜碎片離子分為特征區(qū)含氧碎片離子簇與指紋區(qū)烴鏈碎片離子簇，二者結(jié)合起來可作為GDGTs分子的“身份編碼”，實現(xiàn)對GDGTs分子結(jié)構(gòu)信息的快速表征，可完善GDGTs及其異構(gòu)體信息，并為建立GDGTs分子信息庫提供方法基礎(chǔ)。APPI-P Orbitrap MS對快速鑒定新型GDGT具有重要潛力，但更重要的是，該方法有潛力作為快速識別GDGT及其同系物分子結(jié)構(gòu)特征的工具，這些化合物組成分布可與古環(huán)境參數(shù)建立新的基于GDGT的環(huán)境替代指標(biāo)。

致謝：感謝中國石油大學(xué)(北京)重質(zhì)油國家重點實驗室張未來、常偉峰等老師對本文所做的貢獻。