朱勝虎，趙天行，李爽爽，陳福生*，崔鵬景

（1.江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212043；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

醋酸菌是指以氧氣為終端電子受體，氧化糖（主要是單糖和雙糖）、醇和糖醇生成相應(yīng)的有機(jī)酸、醛、酮等物質(zhì)的革蘭氏陰性細(xì)菌的總稱[1-2]。醋酸菌因具有產(chǎn)生醋酸的能力而得名，被廣泛用于食醋的生產(chǎn)。許多醋酸菌可產(chǎn)生維生素C、細(xì)菌纖維素、果聚糖等有益代謝產(chǎn)物，如氧化葡糖桿菌（Gluconobacter oxydans）中的很多菌株可用于葡萄糖酸生產(chǎn)[3]，醋桿菌（Acetobacter）、葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter）和駒形桿菌（Komagataeibacter）等均可產(chǎn)生細(xì)菌纖維素[4]，公崎桿菌（Kozakia）和新朝井桿菌（Neoasaia）等可合成果聚糖[5]。最近，陳福生等[6]報(bào)道了葡糖醋桿菌FBFS97可以產(chǎn)活性物質(zhì)苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），并對其產(chǎn)PLA的能力進(jìn)行了初步研究。

PLA化學(xué)名為2-羥基-3苯基丙酸或β-苯乳酸、3-苯基乳酸，分子式為C9H10O3。其對多種食源性致病菌[7-10]、腐敗霉菌[11-13]都具有抑菌作用，也是一種可生物降解塑料—聚苯乳酸以及一些藥物（如恩格列酮、司他丁和抗艾滋病藥物）的合成前體[14-15]。因此，在食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。

PLA可以通過化學(xué)和生物方法合成。生物合成法因具有副產(chǎn)物少、環(huán)境友好、合成過程可控等優(yōu)勢，成為許多學(xué)者努力的方向。已報(bào)道的可以合成PLA的微生物有白地霉[16]、丙酸菌[17]、乳酸菌[18-21]等。由于乳酸菌是公認(rèn)安全的微生物，生物法合成PLA的研究主要圍繞乳酸菌進(jìn)行。

本研究通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)以及響應(yīng)面法優(yōu)化葡糖醋桿菌FBFS97產(chǎn)PLA的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，以提高PLA產(chǎn)量，為其推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡糖醋桿菌（Gluconacetobactersp.）FBFS97：由本實(shí)驗(yàn)室保存[6]。苯乳酸（分析純）：上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，pH 5.6。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，酵母粉10 g/L，pH 5.6。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本島津公司；Spursil C18-EP色譜柱（4.6 mm×250 mm）：島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡糖醋桿菌FBFS97種子液制備

將凍存的葡糖醋桿菌FBFS97接種于種子培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液備用。

1.3.2 發(fā)酵條件對葡糖醋桿菌FBFS97產(chǎn)PLA的影響單因素試驗(yàn)

以葡糖醋桿菌FBFS97為試驗(yàn)菌株，初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別考察培養(yǎng)基組成的碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖漿、甘油、乳糖），氮源（酵母粉、玉米漿粉、豆粉、蛋白胨、牛肉膏、NH4NO3、（NH4）2SO4），無機(jī)鹽（檸檬酸鈉、K2HPO4、ZnSO4·7H2O、MnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O）添加量1.0 g/L，pH（3、4、5、6、7）以及發(fā)酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、裝液量（20 mL/250mL、40 mL/250 mL、60mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL、120mL/250mL）對葡糖醋桿菌FBFS97產(chǎn)PLA的影響。

1.3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以果糖、酵母粉、K2HPO4添加量及pH、發(fā)酵溫度和裝液量為自變量，每個因素取兩個水平，PLA產(chǎn)量為響應(yīng)值，篩選出對PLA產(chǎn)量影響較為顯著的因素。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment

1.3.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，將顯著影響因子根據(jù)正負(fù)效應(yīng)往最優(yōu)方向進(jìn)行調(diào)整，設(shè)計(jì)合理步長，逼近最強(qiáng)響應(yīng)區(qū)域。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以酵母粉、pH、裝液量為評價(jià)因素，以PLA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)得出的最佳發(fā)酵條件，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，確定優(yōu)化結(jié)果。

1.3.6 測定方法

將培養(yǎng)液8 000 r/min離心5 min，上清液0.22 μm濾膜過濾后，采用HPLC法測定PLA的含量。每次試驗(yàn)設(shè)3個平行。

高效液相色譜工作條件[22]：流動相為0.1%的甲酸水溶液（A）和乙腈（B）；采用梯度洗脫：0～15 min，80% A；15～20 min，10% A；20.01～25 min，80% A；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃；檢測器為二極管陣列檢測器；檢測波長210 nm。

以苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品作為外標(biāo)，進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

探究碳源、氮源、無機(jī)鹽、pH、發(fā)酵溫度和裝液量6個單因素對葡糖醋桿菌FBFS97合成PLA的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，以葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖漿、甘油、乳糖作為候選碳源，篩選出最優(yōu)碳源為果糖，PLA產(chǎn)量為103.33 mg/L；以酵母粉、玉米漿粉、豆粉、蛋白胨、牛肉膏、NH4NO3、（NH4）2SO4為候選氮源，篩選出最優(yōu)氮源為酵母粉，PLA產(chǎn)量為77.84 mg/L；以檸檬酸鈉、K2HPO4、ZnSO4·7H2O、MnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O為候選無機(jī)鹽，篩選出最優(yōu)無機(jī)鹽為K2HPO4，PLA產(chǎn)量為86.1 mg/L；最佳發(fā)酵條件為pH 5.0、發(fā)酵溫度25 ℃、裝液量40 mL/250 mL，相應(yīng)條件時PLA產(chǎn)量分別為66.71 mg/L、71.22 mg/L和51.06 mg/L。上述結(jié)果與醋酸菌的特性以及PLA合成途徑的影響因素相符。醋酸菌最適生長溫度約30 ℃，超過34 ℃幾乎不生長，少數(shù)醋酸菌可以耐受42 ℃的高溫[23]。裝液量與發(fā)酵液的溶氧量有關(guān)，醋酸菌是好氧細(xì)菌，O2有利于醋酸菌生長與代謝，并對發(fā)酵速率影響顯著[24]。果糖在PLA生物合成過程中可充當(dāng)電子受體，促進(jìn)PLA的合成[25]。K2HPO4能顯著提高乳酸片球菌CRL 1753產(chǎn)PLA能力[26]，因?yàn)殁涬x子對PLA合成相關(guān)的莽草酸途徑中的多種酶具有激活作用[27]。

圖1 碳源（A）、氮源（B）、無機(jī)鹽（C）、pH值（D）、發(fā)酵溫度（E）、裝液量（F）對葡糖醋桿菌FBFS97產(chǎn)苯乳酸的影響Fig.1 Effect of carbon source (A),nitrogen source (B),inorganic salt(C),pH (D),fermentation temperature (E),loaded liquid (F) on phenyllactic acid production by Gluconacetobacter sp.FBFS97

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見表2，采用Design Expert 8.0.6軟件對各試驗(yàn)因素做主效應(yīng)分析，結(jié)果見表3。由表3可知，對PLA產(chǎn)量影響的因素從大到小的排序分別為B（酵母粉）、D（pH）、F（裝液量），其他因素對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析及主效應(yīng)分析Table 3 Variance analysis and main effect analysis of Plackett-Burman experiments

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，B因素呈正效應(yīng)，D和F因素呈負(fù)效應(yīng)。設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，在第3組試驗(yàn)的條件下，PLA產(chǎn)量最大，故以第3組試驗(yàn)的條件作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest climbing experiments

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案對PLA發(fā)酵進(jìn)行3因子3水平的響應(yīng)面分析，以酵母粉（A）、pH（B）、裝液量（C）為自變量，以PLA產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表5。對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，并對該模型及相關(guān)參數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model of response surface experiments

對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面二次回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y=202.39+12.09A-4.22B+1.07C-2.36AB-9.35AC-2.55BC-62.53A2-18.87B2-11.43C2

由表6可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明回歸模型與實(shí)際值非常吻合。該模型的決定系數(shù)R2為0.972，表明該回歸方程與實(shí)際擬合度較好，預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)性好。一次項(xiàng)A對產(chǎn)PLA具有極顯著影響（P＜0.01）；交互項(xiàng)影響均不顯著（P＞0.05）。構(gòu)建酵母粉與pH、裝液量三者相互影響的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖2。

圖2 酵母粉、pH值和裝液量交互作用對苯乳酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between yeast powder,pH and loaded liquid on phenyllactic acid production

由模型和軟件分析得到葡糖醋桿菌FBFS97產(chǎn)苯乳酸的最優(yōu)發(fā)酵條件：培養(yǎng)基組成為果糖100 g/L、酵母粉40 g/L、K2HPO41.2 g/L，在pH為4.4，裝液量24 mL/250 mL發(fā)酵，溫度為28 ℃條件下150 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，PLA產(chǎn)量達(dá)217 mg/L，是優(yōu)化前的3.52倍。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對葡糖醋桿菌FBFS97發(fā)酵產(chǎn)PLA的培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為果糖100 g/L、酵母粉40 g/L、K2HPO41.2 g/L，pH為4.4；發(fā)酵條件為裝液量24 mL/250 mL，于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)8 d。在此優(yōu)化條件下，PLA產(chǎn)量達(dá)217 mg/L，是優(yōu)化前的3.52倍。