王韻怡，周南，樂嘉誠，張凱，趙乾皓，鄭大，胡丙杰，成建定

1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州510080；2.廣州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，廣東 廣州511436

冠狀病毒（coronavirus，CoV）是一類廣泛存在于自然界、直徑80～160 nm、基因組全長27～32 kb、可引起人畜共患病的單股正鏈RNA 病毒。這類病毒在分類上屬套式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬，有包膜，表面有多形性花冠狀突起，包括突起（spike，S）蛋白、膜（membrane，M）蛋白、小膜（envelope，E）蛋白和核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白4 種結(jié)構(gòu)蛋白[1]。冠狀病毒主要引起呼吸及消化系統(tǒng)疾病，其中嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）冠狀病毒、中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS）冠狀病毒分別在2003 年和2012 年在全球引起了感染大流行，2019 年年底，SARS-CoV-2 來襲，引發(fā)了嚴(yán)重的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情。

冠狀病毒傳染性較強(qiáng)，重癥死亡率較高。冠狀病毒感染性疾病在短短17 年之內(nèi)發(fā)生3 次世界大流行，強(qiáng)烈提示此類疾病的防治將是我們未來的一項(xiàng)長期工作，值得高度重視。病原學(xué)檢測不僅是臨床確診傳染性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，也是傳染性疾病尸體檢驗(yàn)、病原學(xué)研究的重要內(nèi)容。目前，SARS-CoV-2陽性與COVID-19 臨床病程的動態(tài)變化關(guān)系尚未闡明，如病程中的患者病毒核酸檢測陰性、康復(fù)出院患者核酸檢測再次陽性等問題十分突出。在此類傳染病死者的尸體檢驗(yàn)中開展細(xì)致的病原學(xué)研究，對于揭示病毒感染人體的途徑、靶器官及其時(shí)空分布規(guī)律，并進(jìn)一步闡明其致病機(jī)制，對指導(dǎo)臨床患者的病原學(xué)診斷、療效和康復(fù)判斷具有十分重要的意義。本文通過系統(tǒng)介紹冠狀病毒感染性疾病SARS 和MERS 等尸體檢驗(yàn)病例的病原學(xué)研究情況，以期為正在流行的COVID-19 及今后可能的冠狀病毒感染性疾病尸體解剖的病原學(xué)研究提供借鑒和參考。

1 SARS

SARS 又稱非典型肺炎，是由SARS-CoV 引起的累及多器官的傳染性疾病，主要表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)熱、呼吸困難等呼吸道癥狀。

1.1 光鏡觀察

通過常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色或特殊麥?zhǔn)希∕acchiavello）染色法，光鏡下即可觀察 到 病 毒 包 涵 體[2-3]。LANG 等[4]將3 例SARS 死 亡 患者的肺組織經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，HE 染色，在肺泡上皮內(nèi)檢見病毒包涵體樣結(jié)構(gòu)，呈球形、類似紅細(xì)胞大小、嗜酸性染色、帶空暈的均質(zhì)無結(jié)構(gòu)小體。賴日權(quán)等[5]對1 例SARS 死亡患者部分肺組織進(jìn)行Macchiavello 染色，在肺泡上皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)檢見病毒包涵體。

1.2 透射電鏡觀察

將尸體檢驗(yàn)各部位標(biāo)本用2.5%戊二醛溶液固定，1%鋨酸溶液后固定，梯度脫水，浸透，環(huán)氧樹脂制劑Epon812 包埋，超薄或半薄切片、定位，可在透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）下觀察是否存在病毒顆粒[6]。趙景民等[7]在1 例SARS 死亡解剖病例組織標(biāo)本中，觀察到肺組織中多數(shù)Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞及細(xì)小支氣管上皮細(xì)胞、部分肺泡間隔毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，淋巴結(jié)和脾內(nèi)部分單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞內(nèi)，以及部分心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)和腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)或擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可查見較多病毒顆粒。

1.3 病毒分離與滴定

由于受到樣本儲存、切片制備以及觀察方法等影響，有時(shí)并不能在組織切片中觀察到病毒顆粒，必要時(shí)可進(jìn)行病毒分離，具體方法可參考文獻(xiàn)[8]。趙景民等[7]在患者鼻咽拭子、含漱液、腎等組織分離到SARSCoV。朱雷等[9]分別采集1 例SARS 死者解剖病例的心、肺、肝、脾等組織，接種細(xì)胞后，源于心、肺標(biāo)本者在第1 代即可分離出病毒，而源于肝、脾標(biāo)本者則在第2 代分離出病毒，說明心、肺標(biāo)本病毒含量較肝、脾標(biāo)本高，進(jìn)一步證實(shí)SARS-CoV 可以感染患者多個(gè)主要器官，且對心、肺組織侵害強(qiáng)于肝、脾組織。

1.4 病毒核酸檢測

病毒核酸檢測是病毒病原學(xué)檢測中最關(guān)鍵的一種手段，包括全基因組測序和核酸特異性片段檢測。病毒RNA 的來源通常是組織標(biāo)本直接提取物，常用的核酸片段檢測方法大致可以分為核酸測序和核酸原位雜交（in situhybridization，ISH），而核酸檢測的目標(biāo)片段一般選擇SARS-CoV 基因特異性片段或其RNA 聚合酶基因片段。

1.4.1 SARS-CoV基因特異片段檢測

晏輝鈞等[10]采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和巢式PCR 擴(kuò)增等方式，從3 例SARS 死者的部分肺組織中擴(kuò)增出了SARS-CoV RNA 的兩段cDNA 序列。秦杰[11]則應(yīng)用病毒RNA 檢測盒從一些尸體檢驗(yàn)標(biāo)本的鼻咽吸取物和血漿中提取出病毒RNA。

國際上采納較多的是檢測SARS-CoV 編碼N 蛋白和主要抗原S 蛋白的N 區(qū)和S 區(qū)片段，這些片段高度保守，具有代表性，檢出率較高。朱雷等[9]以尸體檢驗(yàn)各組織的病變細(xì)胞提取的RNA 為模板成功擴(kuò)增出部分S 區(qū)和N 區(qū)的cDNA 片段產(chǎn)物。

1.4.2 SARS-CoV RNA聚合酶基因檢測

在病毒的復(fù)制增殖過程中，RNA 聚合酶起重要作用，其基因具高度保守性，因此還可通過檢測其RNA聚合酶基因來檢驗(yàn)病毒的存在。洪濤等[12]在SARS 死者肺組織中擴(kuò)增出CoV RNA 聚合酶基因片段。張慶玲等[13]則對尸體檢驗(yàn)組織切片進(jìn)行原位雜交，檢測其中的SARS-CoV 聚合酶RNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示，多個(gè)部位存在陽性雜交信號，且主要分布于呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等。另外，尸體檢驗(yàn)標(biāo)本的內(nèi)分泌器官雖有較強(qiáng)的RNA 表達(dá)，但并沒有出現(xiàn)明顯的病理形態(tài)學(xué)改變，值得注意。

1.5 病毒相關(guān)蛋白檢測

抗原是尸體檢驗(yàn)中病毒相關(guān)蛋白檢測的主要對象。免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）是尸體檢驗(yàn)中最常用的一種檢測手段，對于法醫(yī)學(xué)鑒定具有重要意義。研究者們多使用抗N、S 蛋白的單克隆抗體進(jìn)行檢測，NICHOLLS 等[14]制備了SARS-CoV核蛋白特異性單克隆抗體，對32 例SARS 死亡患者的尸體檢驗(yàn)肺組織進(jìn)行IHC 染色得到陽性信號。賀莉等[15]對4 例SARS 死者的多個(gè)器官組織石蠟切片用抗SARS-CoV N 蛋白單克隆抗體進(jìn)行IHC 染色，結(jié)果顯示，標(biāo)本的肺上皮細(xì)胞、脾和淋巴結(jié)浸潤的單核細(xì)胞等細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。該團(tuán)隊(duì)還利用抗SARS-CoV S 蛋白單克隆抗體成功檢測到僅在各器官血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme，ACE2）表達(dá)陽性的細(xì)胞中存在強(qiáng)陽性信號[16]。許慧等[17]用全病毒抗原免疫，制備了具有更好反應(yīng)性的抗SARS-CoV 單克隆抗體，并對2 例肺標(biāo)本切片進(jìn)行IHC 染色，也得到了陽性結(jié)果，鏡下有大量棕黃色病毒顆粒。

另外還有多種如膠體金試紙、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等檢測特異性抗體的試劑盒可選用。

2 MERS

MERS 是由MERS-CoV 引起的一種表現(xiàn)為急性肺炎伴發(fā)腎功能衰竭的冠狀病毒感染性疾病，雖與SARS-CoV 同屬冠狀病毒，但作用的受體不同，基因上存在明顯差異。MERS 病死率較SARS 高，由于發(fā)病數(shù)量相對較低，且主要集中在中東地區(qū)阿拉伯半島，因解剖條件受限，有報(bào)道的尸體檢驗(yàn)病例數(shù)較少。

2.1 病毒核酸檢測

病毒核酸特異性片段的擴(kuò)增方法包括多重探針的RT-PCR 和不依賴溫度循環(huán)的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）檢測等，目的基因可包括病毒基因組開放性讀碼框upE、ORF1a、ORF1b、RdRp和N基因等保守區(qū)域[18]。此外，國內(nèi)外還開發(fā)了等溫情況下的重組酶輔助擴(kuò)增（recombinase aided amplification，RAA）技術(shù)的RT-RAA[19]和反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA）[20]等短時(shí)高效的MERS-CoV檢測方法。

2.2 病毒相關(guān)蛋白檢測

YAMAOKA 等[21]制備了抗MERS-CoV N 抗原的單克隆抗體，建立了雙抗體夾心的ELISA 和膠體金檢測方法。SONG 等[22]利用特異性N 蛋白單抗，制備了針對N 抗原的膠體金快速檢測試紙條，都可用于MERS-CoV 抗原的組織切片檢測。

除此之外也有多種檢測血液中特異性抗體的試劑盒，如間接免疫熒光法的試劑盒等。

3 COVID-19

COVID-19 是由SARS-CoV-2 引起的急性呼吸道傳染病。SARS-CoV-2 對人群普遍易感，擴(kuò)散能力強(qiáng)，發(fā)病人數(shù)多，其癥狀可能輕微、甚至無任何臨床表現(xiàn)，但重癥患者易出現(xiàn)多種并發(fā)癥導(dǎo)致死亡。從全球目前的疫情看，總體上COVID-19 的病死率可能低于SARS 和MERS。

3.1 TEM觀察

已有課題組在TEM 下成功觀察到呈球狀或橢圓形、包膜完整、表面有規(guī)律排列的冠狀突起、略呈光暈或花環(huán)狀、核心呈高電子密度的SARS-CoV-2 病毒顆粒[23]。YAN 等[24]利用冷凍TEM 和結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)首次成功解析了SARS-CoV-2 表面S 蛋白受體結(jié)合域與細(xì)胞表面受體ACE2 全長蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)和相互作用方式，證實(shí)了冠狀病毒的器官分布與人體ACE2 蛋白的分布密切相關(guān)，有助于進(jìn)一步了解病毒入侵人體的機(jī)制，并由此提示尸體檢驗(yàn)病原學(xué)檢測的可取材部位。

3.2 病毒的分離

除利用Vero 細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)外，LU 等[25]采用特殊致病性的人氣道上皮細(xì)胞（human airway epithelial cells，HAE）進(jìn)行病毒分離，將患者的咽拭子或肺泡灌洗液接種于HAE 細(xì)胞，通過經(jīng)典的科赫法進(jìn)行病毒的初步鑒定。

3.3 病毒核酸檢測

已有報(bào)道[26]利用高通量宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）的基因組測序技術(shù)方法測得SARS-CoV-2 的全基因組完整序列。WANG 等[27]還研發(fā)了納米孔靶向測序（nanopore targeted sequencing，NTS）的創(chuàng)新性技術(shù)，陽性檢出率較熒光定量RT-PCR 高。多重PCR 擴(kuò)增子測序能夠從病毒載量極低的極端樣本中獲取全基因組信息，其成本較低，更適用于尸體檢驗(yàn)病原學(xué)檢測。

冠狀病毒的快速檢測大多是對高度保守的靶標(biāo)序列ORF1a、ORF1b、N、E基因片段的識別，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 是目前SARS-CoV-2 檢測應(yīng)用最廣泛的一種。有研究[28]結(jié)果表明，新鮮尸體組織和經(jīng)10%甲醛溶液固定的石蠟包埋（formalin fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織均能通過PCR 檢測到SARS-CoV RNA。雖然10%甲醛溶液固定過程會對RNA 產(chǎn)生修飾，限制了RNA 的應(yīng)用，F(xiàn)FPE 組織被認(rèn)為不是獲得原始RNA 的最佳選擇，但可從這些來源中回收可擴(kuò)增RNA。許三鵬等[29]將COVID-19 術(shù)后4 d 死者的肺組織病理石蠟樣本進(jìn)行總RNA 提取，發(fā)現(xiàn)石蠟切片中提取的RNA 質(zhì)量能滿足病毒檢測要求，能夠使用熒光定量PCR 和核酸檢測試劑盒進(jìn)行檢測，提示除了痰液、鼻咽拭子、呼吸道抽取物、肺和氣管灌洗液、肺活檢組織、眼結(jié)膜和肛拭子外，還可將石蠟標(biāo)本作為病毒檢測的補(bǔ)充。由于已有證據(jù)[28-29]證明，尸體組織和FFPE 切片均可提取到滿足核酸檢測條件的病毒RNA，因此，可以嘗試將臨床上病毒核酸檢測的方法運(yùn)用在尸體病原學(xué)檢測上，如LAMP、高靈敏度的微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）、同時(shí)檢測同一病毒多種不同亞型的多重RT-PCR、聯(lián)合探針、基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced short panlindromic repeats，CRISP）的基因編輯技術(shù)CRISPR/CRISPR 相關(guān)系統(tǒng)（CRISPRassociated systems，Cas）檢測靶向RNA、高通量基因芯片以及切口平移法快速篩查等。

3.4 病毒相關(guān)蛋白檢測

在法醫(yī)學(xué)尸體檢驗(yàn)和鑒定過程中，因法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尚無專業(yè)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒的分離和檢驗(yàn)，因此可選擇對病毒相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測。臨床上目前基于抗原和抗體檢測的即時(shí)檢驗(yàn)產(chǎn)品中，大多數(shù)是以IgG、IgM 為檢測目標(biāo)的試劑盒，可用于法醫(yī)現(xiàn)場快速篩查檢測，而一些單克隆抗體產(chǎn)品則適用于IHC 等抗原檢測方法。

3.4.1 病毒抗原檢測

檢測方法包括IHC、Western 印跡法、ELISA 單克隆抗體夾心、免疫膠體金法、免疫熒光法（immunofluorescence assay，IFA）和高通量化學(xué)發(fā)光技術(shù)等。市面上已經(jīng)有可用的抗SARS-CoV-2 S、N 蛋白的單克隆抗體，可用于IHC，還有研究將其應(yīng)用于IFA 并成功檢測到細(xì)胞中病毒抗原[30]。Western 印跡法是一種通過特異性抗體檢測特定抗原的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，可用于檢測病毒本身表面蛋白的表達(dá)或借抗原檢測特異性抗體的存在與活性，但操作較復(fù)雜，免疫模式較固定，且需內(nèi)參，否則結(jié)果的準(zhǔn)確性無法保障。國外有研究[31]利用COVID-19 患者恢復(fù)期血清作一抗，識別出轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞總蛋白中SARS-CoV-2 N、S、E 抗原的蛋白條帶。免疫色譜試紙條和ELISA 均可對抗原或抗體進(jìn)行檢測，前者簡便省時(shí)但靈敏度、特異度不高，后者靈敏度、特異度高，方法靈活，但通量小、費(fèi)時(shí)長?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)同樣可用于檢測抗原或抗體，其靈敏度、特異度高，但檢測設(shè)備成本也高。已有高通量化學(xué)發(fā)光SARS-CoV-2 快速檢測商業(yè)試劑盒，可同時(shí)滿足抗原、抗體的檢測需求，可考慮應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的病毒檢測。

3.4.2 病毒特異性抗體檢測

血清學(xué)檢測特異性抗體IgG、IgM 的主要方法多為膠體金免疫層析法、磁微粒化學(xué)發(fā)光法、免疫熒光法和ELISA。LI 等[32]開發(fā)的IgM-IgG 聯(lián)合抗體檢測試劑盒在15 min 內(nèi)即可通過外周血快速篩查COVID-19，靈敏度和特異性分別達(dá)88.66%和90.63%。基于以上各方法的單人份快速抗體測試卡，操作簡單易觀察，有望應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)現(xiàn)場快速檢測。另有研究[33]采用ELISA 檢測基于重組的SARS-CoV-2 N 蛋白和S 蛋白所構(gòu)建的重組蛋白的IgM、IgG 抗體，結(jié)果顯示，基于N 蛋白和S 蛋白的抗體［IgM 和（或）IgG］檢測陽性率分別為80.4%和82.2%，且檢測陽性率隨著患病天數(shù)的增加而增加，ELISA 法靈敏度高，尤其適用于患病10 d 后患者血清標(biāo)本的檢測，可作為COVID-19診斷的重要補(bǔ)充方法。

4 尸體檢驗(yàn)病原學(xué)檢測的實(shí)踐問題

4.1 檢測方法的選取

SARS-CoV-2 的病原學(xué)檢測方法在臨床實(shí)踐中不斷發(fā)展和更新，但由于尸體檢驗(yàn)工作的特殊性，部分檢驗(yàn)方法無法在法醫(yī)學(xué)實(shí)際工作中應(yīng)用。盡管如此，傳染病尸體檢驗(yàn)的病原學(xué)檢測策略仍能從臨床中獲得啟發(fā)與思考。例如：疑似COVID-19 死者的現(xiàn)場勘驗(yàn)或尸體檢驗(yàn)前，可嘗試?yán)蒙虾＝淮笞T蔚泓院士團(tuán)隊(duì)[34]研發(fā)的一種針對SARS-CoV-2 的便攜式家庭簡易快速檢測試劑盒，該試劑盒僅需對深部氣管吸液或鼻咽部分泌物進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)了對病毒的現(xiàn)場、快速檢測。另外，僅需滴血的IgG-IgM 聯(lián)合抗體檢測試劑簡便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)，有望開展其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的現(xiàn)場運(yùn)用。有團(tuán)隊(duì)利用SARS-CoV S重組蛋白片段和Western 印跡法，反向檢測待測血清中是否存在相應(yīng)的抗體，并與檢測特異性抗體的ELISA 試劑盒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Western 印跡法在ELISA 陰性和部分類似SARS 癥狀的ELISA 陽性病例中有其鑒別意義[35]。法醫(yī)學(xué)SARS-CoV-2檢測也可嘗試使用COVID-19 患者恢復(fù)期血清作為檢測抗體，進(jìn)行Western 印跡法檢測病毒抗原，或開發(fā)病毒抗原重組片段對待測血清進(jìn)行反向檢測。對于受死后變化影響較大的樣本，也可嘗試采用CRISPR/Cas 基因編輯、多重PCR 擴(kuò)增子測序等所需病毒滴度低、靈敏度高的技術(shù)進(jìn)行檢測。

另外，重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)簡單、快速、靈敏，成本低，耗時(shí)短，穩(wěn)定且易于保存[36]，對抑制劑具有很大的耐受性；依賴核酸序列擴(kuò)增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）的檢測儀便攜、適用范圍廣，可實(shí)時(shí)觀測結(jié)果，對靶RNA 定性、定量，擴(kuò)增效率和靈敏度也較高[37]，屬于高通量檢測方法。這兩種技術(shù)均適于快速檢測。而適配體是一種單鏈寡聚核苷酸，其制備簡便、要求低，親和力強(qiáng)，穩(wěn)定性更佳，可以替代抗體作為抗原檢測的探針[38]，目前已有許多研究應(yīng)用適配體對病毒蛋白或全病毒進(jìn)行檢測。第三代反義肽核酸（antisense peptide nucleic acid，antisense PNA）是一種人工合成的多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA 類似物，具有更高的雜交穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物穩(wěn)定性，已用于多種病毒的檢測，在PCR、熒光原位雜交等領(lǐng)域有較廣闊的應(yīng)用，其過程快速、靈敏、高效、準(zhǔn)確、成本低，可檢出更多突變信息[39]。這些技術(shù)在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究，以期探索出適用于法醫(yī)學(xué)病原體檢驗(yàn)的方法。

4.2 檢測結(jié)果的影響因素

死后變化對病原學(xué)檢測結(jié)果有較大的影響。一方面，若死亡時(shí)間過長，死后細(xì)胞自溶可能造成病毒定位和核酸提取困難，廣泛存在的RNA 酶會使不穩(wěn)定的病毒RNA 大部分降解，導(dǎo)致可獲片段過短或過少，無法得到準(zhǔn)確的結(jié)果；另一方面，機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)會在細(xì)胞自溶后釋放的水解酶和腐敗菌的作用下按照一定的規(guī)律逐步降解，死亡時(shí)間過長，就有可能檢測不到特異性抗體或病毒抗原。賴日權(quán)等[5]發(fā)現(xiàn)，在死后即刻的穿刺組織中，肺泡內(nèi)單核巨噬細(xì)胞、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿或擴(kuò)張內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可見清晰的冠狀病毒顆粒，而在死后12 h 的肺組織中病毒顆粒結(jié)構(gòu)模糊，辨別較為困難。陳德蕙[40]認(rèn)為，在尸體組織TEM 樣品制備中，固定非常關(guān)鍵，組織一旦離開血液供應(yīng)，必須立即固定，間隔時(shí)間越短越好，否則會發(fā)生明顯的細(xì)胞自溶，在細(xì)胞內(nèi)的各種病原微生物超微結(jié)構(gòu)保存不佳，可能會失去原有形態(tài)特征，容易與衣原體混淆。

除了死后變化，死者的病程長短也對檢測結(jié)果有影響。據(jù)有關(guān)研究[14]報(bào)道，在發(fā)病后2 周內(nèi)死亡的7 名SARS 患者中，有4 名患者的尸體檢驗(yàn)樣本中出現(xiàn)SARS-CoV N 蛋白陽性染色結(jié)果，其中死于出現(xiàn)癥狀5 d 后的2 例患者病毒感染細(xì)胞數(shù)量最多，而在發(fā)病2 周后死亡的25 例患者中沒有檢測到定位信號。該結(jié)果提示，發(fā)病2 周后肺組織細(xì)胞中的病毒復(fù)制呈下降狀態(tài)，且發(fā)病10～15 d 后從樣本中通過RT-PCR 檢測到的病毒載量開始減少，可能與特異性抗體的出現(xiàn)有關(guān)。因此推斷冠狀病毒肺炎患者病程在2 周內(nèi)者，尸體檢驗(yàn)時(shí)較大可能檢測出病毒陽性結(jié)果，而病程大于2 周者，由于機(jī)體免疫清除、細(xì)胞死后自溶等因素的影響，一般較難出現(xiàn)陽性結(jié)果。

4.3 尸體檢驗(yàn)樣本的獲取、保護(hù)與檢測

在尸體檢驗(yàn)開始前的現(xiàn)場檢測中，對于死亡時(shí)間較短的，可利用外周血、口腔拭子或其他分泌物進(jìn)行快速的病毒篩查，以便預(yù)防病毒傳播。需注意的是，由于SARS-CoV-2 主要引起下呼吸道感染，取氣管、支氣管分泌物要優(yōu)于鼻咽分泌物，亦可嘗試取腦脊液作樣本。若通過尸體檢驗(yàn)進(jìn)行確診，則在尸體檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)以靶器官或病變嚴(yán)重器官（如肺組織）為主要檢測樣本。若研究病毒在體內(nèi)的侵襲分布規(guī)律，則應(yīng)廣泛獲取器官組織（如腎、腸等）。若所取組織塊為石蠟切片，則應(yīng)立即置于4%甲醛溶液或2.5%戊二醛溶液中固定保存。若直接進(jìn)行病毒核酸分析，組織塊應(yīng)用裝有病毒滅活液的保存管保存并立即在2～8 ℃下轉(zhuǎn)運(yùn)送檢，不能立即檢測的需4 ℃或冰上短期保存，提取的RNA 樣本應(yīng)儲存于-70 ℃。分泌物應(yīng)使用專用拭子采樣后置于含核酸酶抑制劑的病毒保存液中，拭子與體液樣本用一次性密封容器封閉其外包裝并用75%乙醇溶液消毒，4 ℃保存。標(biāo)本需給予特殊標(biāo)識并應(yīng)在2～4 h 內(nèi)盡快送檢。尸體檢驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)及人員防護(hù)可參考文獻(xiàn)[41-42]。

標(biāo)本接收后用75%乙醇溶液消毒外包裝，檢測前建議56 ℃45 min 滅活，死后即刻肺穿刺者可在TEM下直接觀察，行組織切片者可進(jìn)行Macchiavello 染色后光鏡觀察，或行IHC 染色。石蠟切片和組織塊、分泌物、外周血等可進(jìn)行病毒RNA 提取后利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR、LAMP 或原位雜交技術(shù)檢測核酸特異性片段，由于病毒可能發(fā)生變異，一般需分別在ORF1a、ORF1b、N基因上選取2 個(gè)靶標(biāo)，或在E基因上選取第三個(gè)靶標(biāo)，也可進(jìn)行全基因組的高通量測序，如多重PCR 擴(kuò)增子測序或探針捕獲測序。所有實(shí)驗(yàn)室檢測過程（如RT-PCR 等）應(yīng)在生物安全防護(hù)（BSL）二級以上的實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行（病毒分離和尸體檢驗(yàn)等則需在BSL-3 設(shè)施中進(jìn)行），并注意個(gè)人防護(hù)。完成檢測后應(yīng)用75%乙醇溶液消毒工作空間并做好個(gè)人清潔，剩余的檢材和廢物應(yīng)經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后按照醫(yī)療廢物的規(guī)定丟棄。

現(xiàn)有病原學(xué)檢測方法主要服務(wù)于臨床病原學(xué)診斷和研究領(lǐng)域，能夠?qū)Σ《镜拇嬖凇⒌味纫约安煌鞴贂r(shí)空分布特征進(jìn)行診斷。通過借鑒臨床的病原學(xué)檢測手段，有望在法醫(yī)學(xué)尸體檢驗(yàn)中引入操作簡便、診斷快速、結(jié)果可靠的技術(shù)，或開發(fā)敏感性高、更適用于尸體組織、病理切片中病原學(xué)檢測的方法與技術(shù)，以解決尸體檢驗(yàn)組織受死后變化等因素限制而導(dǎo)致的RNA 易降解、含量低、取材難的問題。在COVID-19 等冠狀病毒感染性疾病的尸體檢驗(yàn)中開展系統(tǒng)深入的病原學(xué)研究，不僅對法醫(yī)病理學(xué)上病變部位的尋找、疾病的確診以及最后的死因鑒定都具有重要的實(shí)用價(jià)值，而且可望闡明此類病毒侵襲、感染、損害人體器官的時(shí)空規(guī)律，為研究冠狀病毒感染性疾病的發(fā)病機(jī)制和臨床防治策略提供科學(xué)依據(jù)。