李天瑜 袁晉青

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100037)

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是由肝臟合成的絲氨酸蛋白酶，通過分子內(nèi)自身催化剪切后分泌到循環(huán)中，在腸道、胰腺、腎臟和發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)少量表達(dá)，參與多種生物學(xué)功能[1]。正常情況下，肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)，即載脂蛋白B/E受體與循環(huán)中的低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)結(jié)合形成LDLR-LDL復(fù)合物，通過胞吞作用進(jìn)入肝細(xì)胞，隨后LDLR與LDL-C解離，重新回到肝細(xì)胞表面。PCSK9與LDLR的結(jié)合使PCSK9-LDLR-LDL復(fù)合物被靶向到溶酶體降解，阻止了LDLR的重復(fù)利用，導(dǎo)致肝細(xì)胞表面LDLR減少，LDL-C吸收降低，血漿LDL-C水平升高。

盡管PCSK9抑制劑對(duì)心血管疾病患者的益處主要?dú)w因于顯著降低LDL-C，但一些線索提示其也可能影響血小板功能和血栓形成?，F(xiàn)對(duì)PCSK9和PCSK9抑制劑與血小板功能方面的研究進(jìn)展綜述如下。

1 PCSK9和PCSK9抑制劑相關(guān)研究概述

基因修飾動(dòng)物模型和基因突變疾病表型證實(shí)PCSK9調(diào)節(jié)血漿LDL-C水平的作用。腺病毒誘導(dǎo)PCSK9過表達(dá)下調(diào)了小鼠肝臟LDLR，升高了血漿LDL-C水平；PCSK9的功能獲得性突變可導(dǎo)致家族性高膽固醇血癥，表現(xiàn)為高LDL-C水平和早期動(dòng)脈粥樣硬化；而PCSK9的功能喪失性突變則與低LDL-C水平和低心血管風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。因此，抑制PCSK9成為降低血漿LDL-C水平的新策略。目前已有的PCSK9抑制劑包括單克隆抗體、疫苗、類抗體支架蛋白類藥物、多肽、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和小分子抑制劑等。單克隆抗體是研究最成熟的PCSK9抑制劑，在降低血漿LDL-C水平，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，減少心血管事件[2-3](心肌梗死、卒中和不穩(wěn)定型心絞痛/血運(yùn)重建)方面顯示出優(yōu)異的療效。兩種全人源單克隆抗體evolocumab和alirocumab已投入臨床使用，作為心血管疾病患者的二級(jí)預(yù)防和原發(fā)性高脂血癥(包括雜合子家族性高膽固醇血癥)患者進(jìn)一步降低LDL-C的輔助治療；此外，evolocumab還可作為純合子家族性高膽固醇血癥患者進(jìn)一步降低LDL-C的輔助治療。

除了evolocumab和alirocumab已用于臨床外，其他研發(fā)中的單克隆抗體包括LY3015014[4]和RG7652[5]。疫苗可引起PCSK9自身抗體的產(chǎn)生，已有兩種疫苗在動(dòng)物研究中顯示出顯著降低膽固醇、抗血管炎癥和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[6-7]。BMS-962476是一種Adnectin類PCSK9抑制劑(屬于類抗體支架蛋白類藥物)，能迅速降低PCSK9和LDL-C水平[8]。此外，某些合成多肽也能阻止PCSK9與LDLR結(jié)合，其對(duì)血漿LDL-C水平的影響有待進(jìn)一步研究[9-10]。與上述在細(xì)胞外影響PCSK9功能的抑制劑不同，inclisiran是一種siRNA，在肝細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)PCSK9信使RNA(messenger RNA，mRNA)裂解，抑制PCSK9合成，每年需兩次給藥即可長期和顯著地降低LDL-C，最近發(fā)表的臨床試驗(yàn)結(jié)果為inclisiran在臨床使用中的安全性提供了證據(jù)支持[11]。此外，膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑(如K-312和10-去氫姜二酮)也能進(jìn)入肝細(xì)胞，影響PCSK9啟動(dòng)子活性，抑制PCSK9合成，降低PCSK9和LDL-C水平[12-13]。

2 PCSK9和PCSK9抑制劑與血小板功能的相關(guān)性

有研究發(fā)現(xiàn)血漿PCSK9水平與血小板計(jì)數(shù)和血小板壓積呈正相關(guān)[14]，后者能反映殘余血小板反應(yīng)性。ATHERO-AF研究[15]發(fā)現(xiàn)，心房顫動(dòng)患者血漿PCSK9水平與尿液11-去氫-血栓烷B2水平相關(guān)，后者是反映體內(nèi)血小板活化的指標(biāo)，能預(yù)測心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，隨訪結(jié)果證實(shí)血漿PCSK9水平與心房顫動(dòng)患者的心血管事件(包括心源性死亡、心肌梗死、血運(yùn)重建、缺血性腦卒中及短暫性腦缺血發(fā)作)相關(guān)。PCSK9-REACT研究[16]觀察了經(jīng)皮冠脈介入術(shù)后服用替格瑞洛或普拉格雷的急性冠脈綜合征患者，發(fā)現(xiàn)血漿PCSK9水平升高與血小板反應(yīng)性升高明顯相關(guān)，隨訪結(jié)果顯示高PCSK9患者的心血管事件(心源性死亡、心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛、血運(yùn)重建、支架內(nèi)血栓及缺血性腦卒中)發(fā)生率顯著高于低水平PCSK9患者(22.03% vs 3.39%，HR2.62，95%CI1.24～5.52)。Camera等[17]通過氯化鐵誘導(dǎo)小鼠頸動(dòng)脈損傷來評(píng)估PCSK9對(duì)動(dòng)脈血栓形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PCSK9+/+小鼠相比，PCSK9-/-小鼠頸動(dòng)脈血栓形成減少，且為不穩(wěn)定的非阻塞性血栓，進(jìn)一步檢測血小板活化標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體激活、P選擇素表達(dá)及血小板-白細(xì)胞復(fù)合物生成均顯著減少。在體外將PCSK9與血小板共同孵育可增強(qiáng)閾值以下腎上腺素誘導(dǎo)的聚集[17]，直接證明了PCSK9對(duì)血小板功能的正向調(diào)節(jié)作用。

此外，冠心病患者活化的血小板能釋放sortilin[18]，該蛋白可促進(jìn)PCSK9的分泌，在兩項(xiàng)回顧性研究及大鼠心肌梗死模型中均觀察到心肌梗死急性期血漿PCSK9水平短暫性升高[19-20]。據(jù)此推測PCSK9分泌與血小板活化相互放大的惡性循環(huán)可能促進(jìn)了心血管事件的發(fā)生和發(fā)展。

上述研究結(jié)果表明，PCSK9可能通過增強(qiáng)血小板的活化和聚集，參與動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成事件的發(fā)生，PCSK9抑制劑對(duì)血小板功能的影響可能是其降低心血管事件發(fā)生率的原因之一。

一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究[21]評(píng)估了PCSK9單克隆抗體對(duì)家族性高膽固醇血癥患者血小板功能的影響，研究表明evolocumab或alirocumab治療2～12個(gè)月后，血小板活化和聚集顯著減少，血小板對(duì)阿司匹林抑制作用的敏感性顯著提高。一項(xiàng)針對(duì)健康漢族人群的研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9的單核苷酸多態(tài)性rs2495477顯著影響普拉格雷的藥代動(dòng)力學(xué)[22]，以上研究結(jié)果為PCSK9抑制劑在改善血小板高反應(yīng)性方面的應(yīng)用提供了思路。

冠心病合并2型糖尿病患者，其血小板中PCSK9含量是健康人群、單純糖尿病患者和單純冠心病患者的兩倍[23]，以此推測血小板中PCSK9含量可能與2型糖尿病相關(guān)的血小板活化增加和血小板高反應(yīng)性有關(guān)。PCSK9抑制劑是否對(duì)冠心病合并2型糖尿病患者的血小板功能有額外的抑制作用及相關(guān)機(jī)制，仍需進(jìn)一步探索研究。

3 PCSK9抑制劑對(duì)血小板功能的直接影響

血小板表達(dá)Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)-2和TLR-4配體可通過激活TLR/核因子κB(NF-κB)通路引起血小板活化。PCSK9可上調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)TLR-4，增強(qiáng)TLR/NF-κB通路介導(dǎo)的炎癥因子釋放[24]，可假設(shè)PCSK9能通過上調(diào)血小板TLR的表達(dá)促進(jìn)血小板活化。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)將血小板與PCSK9共同孵育時(shí)，PCSK9能引起劑量依賴性的血小板活化，這一作用可被分化簇36(cluster of differentiation 36，CD36)和NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)抑制劑所抑制，表明PCSK9通過與CD36結(jié)合直接作用于血小板，引起NOX2介導(dǎo)的血小板活化，LDL的存在可放大這一作用[25]。另外，血小板中PCSK9含量升高可能與血小板活化增加和血小板高反應(yīng)性相關(guān)[23]。人血小板中未發(fā)現(xiàn)PCSK9 mRNA，而巨核細(xì)胞表達(dá)少量的PCSK9 mRNA，因此血小板中的PCSK9可能來自于巨核細(xì)胞[26]，以上研究提示PCSK9抑制劑可能通過抑制PCSK9對(duì)血小板的作用，干擾PCSK9的合成而直接影響血小板功能。

4 PCSK9抑制劑對(duì)血小板功能的間接影響

血脂異?？捎绊懷“骞δ堋CSK9抑制劑除了顯著地降低血漿LDL-C水平外，還能調(diào)節(jié)脂蛋白a[lipoprotein(a)，Lp(a)]和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)等脂質(zhì)的血漿水平，因此PCSK9抑制劑可能通過對(duì)多種脂質(zhì)的調(diào)節(jié)間接影響血小板功能。

4.1 膽固醇

血小板質(zhì)膜中膽固醇的積聚可能會(huì)改變膜結(jié)構(gòu)并影響膜受體的信號(hào)傳導(dǎo)[27]，增強(qiáng)血小板對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)；反之，質(zhì)膜中膽固醇的消耗則引起血小板對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)下降。此外，Panes等[28]觀察到高膽固醇血癥患者的血小板膜膽固醇含量更高，血小板組織因子及活化凝血因子Ⅹ增多，表明膜膽固醇含量與血小板促凝活性相關(guān)，使用瑞舒伐他汀治療可減少血小板膜膽固醇含量并降低其促凝活性。值得注意的是，該研究并未觀察到他汀類藥物治療影響血小板對(duì)低濃度激動(dòng)劑的反應(yīng)性，提示調(diào)節(jié)血小板促凝活性能預(yù)防動(dòng)脈血栓形成而不增加出血風(fēng)險(xiǎn)。PCSK9抑制劑能顯著地減少血漿膽固醇，可能具有類似的耗竭血小板膜膽固醇和降低血小板活性的作用。

4.2 LDL

天然LDL(native LDL，n-LDL)和氧化型LDL(oxidized LDL，ox-LDL)都可調(diào)節(jié)血小板功能，其中ox-LDL起主要作用。循環(huán)中的n-LDL與血小板表面的載脂蛋白E受體2結(jié)合，促進(jìn)血栓烷A2產(chǎn)生從而激活血小板，但這一過程是暫時(shí)性的，因?yàn)閚-LDL與血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1的結(jié)合抑制了上述反應(yīng)[29]。ox-LDL則通過提高血小板活性，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與血小板黏附等多種途徑影響血小板功能。

ox-LDL提高血小板活性主要是通過與CD36結(jié)合，增加血小板內(nèi)NOX2介導(dǎo)的活性氧合成，降低環(huán)鳥苷酸抑制信號(hào)的強(qiáng)度，導(dǎo)致血小板功能亢進(jìn)[30]。此外，TLR-2和TLR-6與高脂血癥相關(guān)的血小板功能亢進(jìn)相關(guān)，其中TLR-2可能通過獨(dú)立于CD36的途徑增加血小板的反應(yīng)性[31]?；罨难“灞磉_(dá)凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized LDL receptor-1，LOX-1)，使用LOX-1抑制劑可顯著地抑制血小板聚集[32]。以上研究提示ox-LDL與血小板TLR和LOX-1結(jié)合能增強(qiáng)血小板功能，而活化的血小板本身也可將n-LDL氧化為ox-LDL，形成正反饋通路[33]。PCSK9抑制劑可通過下調(diào)血漿ox-LDL水平，減弱后者對(duì)血小板活化的促進(jìn)作用，同時(shí)中斷血小板活化-ox-LDL生成的惡性循環(huán)。在急性冠脈綜合征患者中觀察到ox-LDL與血小板的結(jié)合增加[34]，說明ox-LDL可能在急性血栓形成中起作用，這為PCSK9抑制劑在動(dòng)脈血栓性事件急性期潛在的保護(hù)作用提供了理論支持。

ox-LDL激活巨噬細(xì)胞LOX-1，通過NF-κB通路促進(jìn)炎癥因子的分泌和PCSK9的表達(dá)[35]，PCSK9也可反過來增強(qiáng)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，使用PCSK9 siRNA能抑制ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞的促炎作用。ox-LDL結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1引起內(nèi)皮功能障礙[32]，使內(nèi)皮表現(xiàn)為促凝特性。內(nèi)皮細(xì)胞上的LOX-1還可直接介導(dǎo)血小板黏附[32]。研究顯示PCSK9和LOX-1可正向調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)[35]，因此，除了降低血漿ox-LDL水平，PCSK9抑制劑還可通過下調(diào)LOX-1的表達(dá)減輕其促炎癥相關(guān)性血栓形成的作用。

4.3 Lp(a)

Lp(a)是氧化磷脂(oxidized phospholipids，oxPL)的主要載體，oxPL通過作用于TLR-2激活血小板[36]。然而Lp(a)對(duì)血小板功能的直接影響尚存爭議。已知多種受體可介導(dǎo)Lp(a)的清除，包括LDLR、脂蛋白受體相關(guān)蛋白1和清道夫受體-B1等，PCSK9可介導(dǎo)這些受體的降解，因此使用PCSK9抑制劑可顯著降低血漿Lp(a)水平，從而減少oxPL對(duì)血小板的刺激。

4.4 HDL

HDL可通過非受體依賴的機(jī)制促進(jìn)血小板膜膽固醇的流出[37]。此外，HDL與ApoER2結(jié)合增加了血小板一氧化氮的合成，上調(diào)血小板內(nèi)環(huán)鳥苷酸，從而抑制血小板聚集[38]。天然HDL和氧化型HDL均可結(jié)合清道夫受體-B1影響血小板功能，且氧化型HDL能更有效地抑制膠原、二磷酸腺苷和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集[39]，PCSK9抑制劑可能通過升高血漿HDL水平間接調(diào)節(jié)血小板功能。

5 小結(jié)與展望

PCSK9單克隆抗體在降低血漿LDL-C水平，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展和減少心血管事件方面療效顯著。疫苗、類抗體支架蛋白類藥物、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑及siRNA等已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床試驗(yàn)中顯示了初步療效，與單克隆抗體相比，可能具有價(jià)格低廉和給藥次數(shù)少等優(yōu)勢，是未來有望應(yīng)用于臨床的PCSK9抑制劑。越來越多的證據(jù)表明PCSK9抑制劑降低心血管事件的作用可能部分歸因于其對(duì)血小板功能的影響。PCSK9抑制劑能直接或間接地影響血小板功能，可能的機(jī)制包括抑制PCSK9對(duì)血小板的作用，減少血小板PCSK9含量，減少血小板膜膽固醇，降低LDL和Lp(a)對(duì)血小板活化的促進(jìn)作用，增強(qiáng)HDL對(duì)血小板聚集的抑制，減輕巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的促炎癥相關(guān)血栓形成作用。

闡明PCSK9抑制劑對(duì)血小板功能的影響可能會(huì)拓寬這類藥物的適應(yīng)證，如PCSK9抑制劑可作為輔助抗血小板藥物用于合并高脂血癥和糖尿病等血小板活性升高的代謝性疾病的患者，改善血小板對(duì)阿司匹林和氯吡格雷等經(jīng)典抗血小板藥物的高反應(yīng)性。另外，由于在急性冠脈綜合征患者中觀察到血漿PCSK9水平的升高和ox-LDL與血小板結(jié)合的增加，PCSK9抑制劑在缺血性心血管疾病急性期治療中的潛在作用也是值得研究的方向。