郝曉華，曹麗蓉，羅淑政，宿 婧

（忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州 034300）

薄荷，唇形科多年草本植物，臨床多用于風(fēng)熱感冒、溫病初起、頭痛目赤、咽喉腫痛等癥。有利膽、鎮(zhèn)靜止痛、驅(qū)除害蟲等功效。薄荷水提液有比較顯著的抗氧化活性（李佩佩等，2014；郭曉恒等，2013；房海靈等，2010），對(duì)具有氧化性的自由基有較高的清除作用。多糖是一類由多個(gè)單糖通過糖苷鍵連接起來的大分子，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)。多糖對(duì)許多微生物的生長(zhǎng)和繁殖有可能造成生長(zhǎng)拮抗，但其機(jī)制還不太清楚（張?zhí)苽サ龋?011），多糖還有抗腫瘤（Sun 和Zhou，2012）、抗氧化（Fan等，2012）、抗病毒（Navid 等，2012）和免疫調(diào)節(jié)（Yi等，2012；Li 等，2012）等功效。近年來多糖的藥理作用研究日益受到關(guān)注，但對(duì)于薄荷多糖的研究卻鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波法提取薄荷多糖，以期為薄荷多糖的產(chǎn)品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)，為薄荷的充分開發(fā)利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 UV-2102C 型紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；HC-2062 高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；KQ3200DV 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

干薄荷，購(gòu)買于忻州市五臺(tái)山大藥房；95%乙醇（含量≥95%），天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；苯酚、葡萄糖、濃硫酸、水楊酸。以上藥品及試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波法提取薄荷多糖 將干薄荷葉粉碎后過60 目篩。稱取1.00 g 薄荷粉末于100 mL 小燒杯中，以一定的料液比加入蒸餾水充分混勻，70°C 水浴加熱20 min 后，調(diào)節(jié)超聲波清洗儀的各項(xiàng)參數(shù)（功率、時(shí)間、溫度按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的數(shù)值設(shè)置），超聲處理后離心（4200 r/min，15 min）、過濾，再將沉淀加入一定量的蒸餾水以相同的料液比和超聲條件提取，離心、過濾后合并兩次濾液，將濾液濃縮至10 mL，加入無水乙醇，冷藏放置（4 ℃）24 h，充分醇沉后離心（4200 r/min，15 min），將沉淀物置于干燥箱（50 ℃，60 min）烘干，得到多糖粗制品。

1.2.2 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 準(zhǔn)確稱取葡萄糖0.01 g，倒入蒸餾水不停攪拌，待溶解之后定容到100 mL 即為葡萄糖母液。準(zhǔn)確取量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 母液于刻度試管中，每管加入一定量的蒸餾水使其體積為1 mL，滴加濃硫酸5 mL 和5%苯酚溶液1 mL，充分振蕩搖勻，待冷卻至室溫后測(cè)490 nm 下吸光度，繪制多糖濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（戴喜末等，2011；王桃云等，2011）。

1.2.3 薄荷多糖提取率的測(cè)定 按照如下公式計(jì)算薄荷多糖的提取率（張保等，2016）：

提取率/%=（CV/1000 m）×100%；

式中：C 為多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為樣品溶液的總體積，mL；m 為薄荷粉末的質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 稱取1.00 g 薄荷粉末于燒杯中，以蒸餾水為提取劑，在料液比1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90，超聲時(shí)間20、25、30、35、40 min，超聲溫度20、30、40、50、60 ℃，超聲功 率90、105、120、135、150 W 的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組做三個(gè)重復(fù)，考察各因素對(duì)薄荷多糖提取率的影響程度。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化分析超聲波法提取薄荷多糖最優(yōu)條件 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，以提取薄荷多糖影響顯著的三個(gè)因素以及每一個(gè)因素中提取率較高的三個(gè)參數(shù)設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)（表1）。

表1 薄荷多糖提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3 薄荷粗多糖抗氧化性研究

1.3.1 薄荷粗多糖清除DPPH 自由基能力的測(cè)定滴加0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL 多糖溶液1 mL 于各試管中，添加0.2 mmol/L DPPH·溶液3 mL，避光放置30 min 后測(cè)其在517 nm 的吸光度記作A1，取1 mL 薄荷多糖溶液加入3 mL 95%乙醇，避光放置30 min 后測(cè)其在517 nm 的吸光度記作A2，取1 mL 蒸餾水加入3 mL DPPH·溶液，避光放置30 min 后測(cè)其在517 nm 的吸光度記作A0，不同濃度的多糖溶液對(duì)DPPH 自由基的清除率公式為：清除率/%=A0-（A1-A2）/A0×100。將維生素C 作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照薄荷多糖的抗氧化性強(qiáng)弱（楊潤(rùn)亞等，2012；劉然等，2012；陳麗嬌等，2012）。

1.3.2 薄荷粗多糖清除羥自由基能力的測(cè)定 滴加0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL 多糖溶液1 mL 于各試管中，加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L 乙醇水楊酸和6 mmol/L H2O2各1 mL，搖勻后5000 r/min 離心5 min，在510 nm 測(cè)其吸光度記作Ax，將多糖溶液換成1 mL 蒸餾水按上述方法測(cè)其吸光度記作Ax0，將H2O2換成1 mL 蒸餾水按上述方法測(cè)其吸光度記作Ax1，不同濃度的多糖溶液對(duì)羥自由基的清除率計(jì)算為：清除率/%=Ax0-（Ax-Ax1）/Ax0×100。將維生素C 作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照薄荷多糖的抗氧性強(qiáng)弱（許小向等，2015）。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程見圖1。各數(shù)值均采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行處理，得出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程：y=13.9248x+0.0064，并以該方程計(jì)算薄荷多糖的含量。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 薄荷多糖的提取單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 料液比對(duì)薄荷多糖提取率的影響 由圖2可知，在150 W、50 ℃、20 min 的條件下，料液比1∶50 時(shí)多糖得率最高。溶劑增加后，多糖的浸出率也隨之增加，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)多糖浸出率達(dá)到最大值后，溶劑繼續(xù)增加只會(huì)使提取率下降，所以選用1∶50作為薄荷多糖提取的最佳料液比。

圖2 料液比與薄荷多糖提取率折線圖

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)薄荷多糖提取率的影響 由圖3 可知，在50 ℃、150 W、1∶50 的條件下，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)多糖提取率總體呈先升后降的趨勢(shì)。超聲波可破碎細(xì)胞，時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞破碎越充分，多糖提取率上升。但超聲時(shí)間過長(zhǎng)可能使多糖結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致提取率下降。35 min 時(shí)，薄荷多糖的提取率最高，故選用35 min 作為薄荷多糖最佳超聲時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間與薄荷多糖提取率折線圖

2.2.3 超聲溫度對(duì)薄荷多糖提取率的影響 由圖4 可知，在35 min、150 W、1∶50 的超聲條件下，隨著超聲波提取溫度升高，提取率先升高后降低。溫度高時(shí)分子運(yùn)動(dòng)快，有利于多糖溶出，在40 ℃時(shí)薄荷多糖的提取率達(dá)到最高，所以選用40 ℃作為薄荷多糖的最適提取溫度。

圖4 超聲溫度與薄荷多糖提取率折線圖

2.2.4 超聲功率對(duì)薄荷多糖提取率的影響 由圖5 可知，在1∶50、40 ℃、35 min 的條件下，隨著超聲功率的增大，提取率先升后降，可能是因?yàn)樵谙嗤瑫r(shí)間及料液比的情況下，功率越大，細(xì)胞破碎越多，使多糖的提取率上升，但功率過大會(huì)使非糖物質(zhì)大量浸出使多糖得率降低。本試驗(yàn)中超聲功率為135 W 時(shí)薄荷多糖的提取率最高，選用135 W作為薄荷多糖的最佳提取功率。

圖5 超聲功率與薄荷多糖提率折線圖

2.3 超聲波法提取薄荷多糖工藝的響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 將表1 內(nèi)容輸入Design—Expert8.0.5 軟件中，得到薄荷多糖的提取率為響應(yīng)值的17 組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 薄荷多糖提取工藝響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 二次項(xiàng)數(shù)學(xué)模型的可行性分析 由表3 可知P=0.0124＜0.05，說明該方程得到的工藝條件對(duì)實(shí)際操作影響顯著，這個(gè)方程得到的條件可用于提高薄荷多糖提取率；失擬項(xiàng)P=0.4406＞0.05，說明方程得到的理論值和真實(shí)值相差不大，可以用于現(xiàn)實(shí)的生產(chǎn)操作中。綜上所述，可使用該數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)超聲波法提取薄荷多糖的最優(yōu)提取工藝以及在該條件下的最高提取率。本研究得到的二次項(xiàng)方程為：Y=1.55 +0.051A -0.017B +0.10C +0.075AB-0.072AC+0.085BC -0.091A2-0.044B2-0.19C2（A 超聲功率、B 超聲時(shí)間、C 料液比、Y 提取率）。

依據(jù)表3 可知各要素改變提取率的能力從小到大依次為：超聲時(shí)間（F=0.35）＜超聲功率（F=2.99）＜料液比（F=12.23），在三個(gè)要素中，料液比（C）對(duì)薄荷多糖提取率的影響非常顯著（P ≤0.01），功率和時(shí)間（A、B）對(duì)提取率影響不顯著（P＞0.05），各交互項(xiàng)（AB、AC、BC）對(duì)薄荷多糖提取率的影響也不顯著（P ＞0.05），功率和時(shí)間的二次項(xiàng)（A2、B2）對(duì)薄荷多糖提取率的影響不顯著（P ＞0.05），料液比的二次項(xiàng)（C2）對(duì)薄荷多糖提取率的影響非常顯著（P ＜0.01）。

表3 方差分析表

2.3.3 交互項(xiàng)及等高線圖、三維曲線圖 響應(yīng)曲面圖中曲面的陡峭程度越大，對(duì)提取率的影響程度越大。等高線圖可反映因素之間的交互作用，越偏圓形，表示交互不顯著。越偏橢圓，表示交互顯著。由圖6（a）可知功率一側(cè)的曲面比時(shí)間一側(cè)陡峭，說明功率對(duì)提取率的影響更大；由圖6（b）可以看出，等高線不夠密集，呈橢圓形，結(jié)合方差分析表，可知超聲功率和時(shí)間之間存在相互影響但是影響不大。由圖7（a）可以看出，在料液比一側(cè)的曲面比超聲功率一側(cè)更陡峭，故料液比對(duì)薄荷多糖提取率影響更大；由圖7（b）可看出，等高線不夠密集且接近圓形，說明超聲功率和料液比之間相互影響較??；由圖8（a）可看出在料液比一側(cè)的曲面比時(shí)間一側(cè)更陡峭，說明料液比對(duì)薄荷多糖提取率影響更大；由圖8（b）可以看出，等高線密集且為橢圓形，料液比和超聲時(shí)間之間有相互影響且影響較大。

圖6 超聲功率和時(shí)間的交互作用曲線圖（a）和等高線圖（b）

圖7 超聲功率和料液比的交互作用曲線圖（a）和等高線圖（b）

圖8 超聲時(shí)間與料液比的交互作用曲線圖（a）和等高線圖（b）

2.3.4 響應(yīng)面分析優(yōu)化薄荷多糖提取最優(yōu)條件采用Design Expert8.0.5 分析數(shù)據(jù)，得出超聲波法提取薄荷多糖的最優(yōu)條件：功率134.39 W、時(shí)間30.09 min、料液比1∶55.80，提取率約為1.57%。在實(shí)際操作中，為了增加試驗(yàn)的可行性，可將預(yù)測(cè)的超聲波法提取薄荷多糖最優(yōu)工藝修改為：超聲功率135 W、超聲時(shí)間30 min、料液比為1∶56，在此條件下重復(fù)三次，提取率平均值為1.57%，高于單因素試驗(yàn)結(jié)果，證明響應(yīng)面得到的方程是可靠的。

2.4 測(cè)定薄荷粗多糖的抗氧化性能力

2.4.1 薄荷粗多糖清除DPPH 自由基能力的測(cè)定結(jié)果 由圖9 可知，隨著維生素C 濃度的增大，其清除率增大，抗氧化性越強(qiáng)，樣品和維生素C 的抗氧化性不斷接近，最大清除率可達(dá)到維生素C 的86.3%，證明薄荷多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性。

圖9 薄荷粗多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用

2.4.2 薄荷粗多糖清除羥自由基能力的測(cè)定結(jié)果由圖10 可知，隨著樣品（維生素C）濃度的增大，其對(duì)羥自由基的清除率增大，樣品和維生素C 的清除率不斷接近，當(dāng)薄荷多糖濃度為0.045 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為71.50%，因此薄荷多糖對(duì)羥自由基具有明顯的清除作用。

圖10 薄荷粗多糖對(duì)羥自由基的清除作用

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取薄荷多糖的提取條件，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果采用薄荷多糖得率較高的因素和水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。得出以下結(jié)論：超聲時(shí)間、超聲功率、料液比三個(gè)因素之間交互作用較??；響應(yīng)面采用的三個(gè)因素對(duì)薄荷多糖提取率影響程度由小到大依次是：超聲時(shí)間＜超聲功率＜料液比；本研究最終得到薄荷多糖的最佳提取條件為：超聲時(shí)間30 min、超聲功率135 W、料液比1∶56，在此條件薄荷多糖的提取率為1.57%。得出最優(yōu)工藝后，采用優(yōu)化后的試驗(yàn)條件提取薄荷粗多糖，用于進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)。隨著薄荷多糖濃度不斷增大，抗氧化性增強(qiáng)。當(dāng)濃度增加到一定值后其抗氧化性與維生素C相差無幾，說明薄荷多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性。