章燁雯,呂其壯,陳 榮,樊燕萍,臧青民
(玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院,廣西玉林 537000)
四時(shí)青又名云實(shí)葉,為豆科云實(shí)屬植物云實(shí)的干燥葉片(魏小華,2012),具有清熱解毒,祛瘀止痛等功效,也可在一定程度上維持動(dòng)物體內(nèi)的代謝平衡,防治疾病,目前已有研究將其作為飼料添加劑使用(王文輝等,2017;田志超等,2012)。四時(shí)青化學(xué)成分復(fù)雜多樣,主要含有萜類、黃酮類及生物堿等,其中高異黃酮和卡薩烷二萜類為特征性成分(Yuben 等,2018)。黃酮類化合物作為普遍存在于植物中的一類成分,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等生物活性(吳兆華等,2007);另外,其作為飼料添加劑能促進(jìn)動(dòng)物健康育肥,增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力,同時(shí)提高肉類品質(zhì)(馮香安等,2011)。目前對(duì)于四時(shí)青的研究主要集中在化學(xué)成分和生物活性上(李昌勤等,2016;李茂星等,2002),但對(duì)其黃酮類成分提取工藝的研究鮮有報(bào)道。因此,本試驗(yàn)在參考相關(guān)植物總黃酮提取工藝的基礎(chǔ)上(唐春偉等,2019),采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn),研究四時(shí)青總黃酮的最佳提取工藝,以期為進(jìn)一步開發(fā)四時(shí)青提供一定的依據(jù)。
1.1 儀器與試劑 電子天平(JA2003,舜宇恒平);新型密封式粉碎機(jī)(雷邁);數(shù)碼超聲波清洗器(KQ-500DV,昆山);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2,國(guó)華);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000A,亞榮);循環(huán)水式多用真空泵(SHB-III,長(zhǎng)城科工貿(mào));紫外可見分光光度計(jì)(A360,翱藝)。
四時(shí)青采摘于廣西南寧上林縣的一丘陵地,經(jīng)鑒別為豆科,云實(shí)屬植物云實(shí)的葉;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為分析純。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg,置于100 mL 量瓶中,用60%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 置100 mL 容量瓶,添加60%乙醇至25 mL;分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL,搖勻,靜置6 min;再加入10% 硝酸鋁溶液1.5 mL,搖勻,靜置6 min;最后加入4% 氫氧化鈉溶液20 mL,用60%乙醇定容至刻度,搖勻,靜置12 min。用紫外分光光度計(jì)(λ=510 nm)測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值,以濃度(C)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(黃明堦等,2009)。
1.2.2 四時(shí)青總黃酮提取率的測(cè)定 根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮的質(zhì)量濃度,提取率按下式計(jì)算:
式中:C 為四時(shí)青總黃酮的質(zhì)量濃度,mg/mL;N 為稀釋倍數(shù);V 為樣品液體積,mL;M 為樣品質(zhì)量,g;T 為四時(shí)青總黃酮的提取率,%。
1.2.3 單因素試驗(yàn) 以四時(shí)青總黃酮的提取率為指標(biāo),分別設(shè)置乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、提取時(shí)間(15、30、45、60、75min)和溶劑倍量(5、10、15、20、25)為考察因素和水平,篩選出影響四時(shí)青總黃酮提取的較優(yōu)水平。
1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以四時(shí)青總黃酮的提取率為考察指標(biāo),采用L9(34)正交表安排試驗(yàn),因素水平見表1。
表1 正交試驗(yàn)因素水平
1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 20.0 軟件對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程y=11.864x-0.0019(R2=0.9994),結(jié)果見圖1。表明蘆丁在0.004~0.040 mg/mL 與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 乙醇濃度對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響乙醇作為一種常用的綠色溶劑,可以滿足不同類別成分的提取需要,滲透力強(qiáng)。如果乙醇的濃度過小容易導(dǎo)致水溶性雜質(zhì)的溶出,如果過大容易導(dǎo)致色素、樹脂等脂溶性雜質(zhì)的溶出。本單因素試驗(yàn)固定溶劑倍量15、提取時(shí)間60 min,研究系列乙醇濃度對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響,結(jié)果見圖2。在一定濃度范圍內(nèi),隨著乙醇濃度的升高,四時(shí)青總黃酮的提取率增大,但當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí),由于四時(shí)青中葉綠素、苷元等雜質(zhì)的溶出量增加,從而影響總黃酮的提取。
圖2 乙醇濃度對(duì)提取率的影響
2.2.2 提取時(shí)間對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響提取過程的完成需要一定的時(shí)間,即有效成分溶出、擴(kuò)散達(dá)到平衡的時(shí)間。時(shí)間太短,有效成分浸出不完全,時(shí)間太長(zhǎng),造成浪費(fèi),導(dǎo)致無效成分和雜質(zhì)溶出增加,甚至使有效成分降解失活。本單因素試驗(yàn)固定溶劑倍量15,乙醇濃度60%,研究不同提取時(shí)間對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響,結(jié)果見圖3。隨著提取時(shí)間的增加,四時(shí)青總黃酮的提取率增大,但當(dāng)提取時(shí)間超過60 min 時(shí),由于四時(shí)青中其他化合物也會(huì)溶出,從而影響總黃酮的提取。
圖3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響
2.2.3 溶劑倍量對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響溶劑用量的加大,有效成分可以充分?jǐn)U散,但用量過大也會(huì)給后續(xù)工藝操作帶來不便。本單因素試驗(yàn)固定提取時(shí)間60 min,乙醇濃度60%,研究不同溶劑倍量對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響,結(jié)果見圖4。隨著溶劑倍量的增加四時(shí)青總黃酮的提取率增大,但當(dāng)溶劑倍量大于10 時(shí),總黃酮溶出不再增加。
圖4 溶劑倍量對(duì)提取率的影響
2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果
2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析結(jié)果見表2。由極差分析可知,溶劑倍量和乙醇濃度對(duì)四時(shí)青總黃酮提取影響較大,各因素主次順序?yàn)椋喝軇┍读浚疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間,較優(yōu)提取工藝為A2B2C2。
表2 四時(shí)青總黃酮正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
2.3.2 方差分析 由表3 可知,B、C 對(duì)總黃酮提取率影響顯著(P <0.05),A 對(duì)總黃酮提取率影響不顯著(P >0.05),影響四時(shí)青總黃酮提取率的主次因素為C >B >A,與表2 中分析結(jié)果相同。因此四時(shí)青總黃酮的最佳提取工藝條件為:提取時(shí)間60 min,乙醇濃度60%,溶劑倍量10 倍。
表3 正交試驗(yàn)方差分析
2.3.3 提取條件的驗(yàn)證 為驗(yàn)證工藝的的準(zhǔn)確性和合理性,按上述最優(yōu)工藝進(jìn)行提取,平行操作3 份,分別測(cè)定吸光度值,計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果顯示,最優(yōu)工藝下,四時(shí)青總黃酮平均提取率為23.82%,RSD 為1.64%,說明該提取工藝穩(wěn)定、可行。
2.4 提取次數(shù)的確定 由于提取次數(shù)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果影響較大,因此在篩選出最佳條件后對(duì)其單獨(dú)考察。按正交試驗(yàn)確定的工藝提取四時(shí)青,平行操作3 份,每份分別提取2 次,2 次的提取液分別單獨(dú)處理,測(cè)定總黃酮的提取率,結(jié)果見表4。提取2 次與提取1 次相比,總黃酮提取率僅增加了3.04%,結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)成本,四時(shí)青總黃酮的提取次數(shù)確定為1 次。
表4 四時(shí)青總黃酮提取次數(shù)考察%
由單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果可知,各因素中溶劑倍量對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率影響最大,其次是乙醇濃度,對(duì)提取率影響最小的是提取時(shí)間。得到四時(shí)青總黃酮最佳提取工藝條件為:提取時(shí)間60 min,乙醇濃度60%,溶劑倍量10 倍,此條件下總黃酮提取率為23.82%,RSD 為1.64%,表明該提取工藝條件穩(wěn)定、可行。