陳慧 吳娟 鄒宇聰

南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院康復科（廣州 510630）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種發(fā)病機制尚未明確的主要累及中軸骨骼的慢性炎癥性疾病，特征是病理性成骨，最終可進展到脊柱或關節(jié)僵硬和永久性殘疾［1］。因此AS 治療的關鍵在于抑制病理性成骨。DKK-1 是Wnt/βcatenin 通路的天然抑制劑，其表達下調(diào)可促進大量骨質(zhì)形成，是AS 病理性成骨的關鍵因子［2］。研究［3］表明AS 的骨贅形成與DKK-1 降低相關。然而DKK-1 表達下調(diào)機制尚未明確。

表觀遺傳學是在未改變DNA 序列情況下，研究基因可遺傳性表達的一門學科［4］，包括DNA 甲基化、非編碼RNA、組蛋白翻譯后修飾、染色質(zhì)重塑［5］。DNA 甲基化是最常見的表觀遺傳修飾形式，通?；蚋呒谆蓪е禄颉俺聊保?］?；騿幼訁^(qū)域富含CpG 島，是發(fā)生DNA 甲基化的主要區(qū)域［7］。近期研究表明DKK-1 甲基化可促進子宮頸癌［8］、直腸癌［9］、白血病［10］等疾病的進展，而尚無DKK-1 甲基化與AS 的關聯(lián)性研究。為了揭示在AS 中骨贅形成時DKK-1 下調(diào)的機制，選擇髖關節(jié)強直的AS 患者為研究對象，檢測骨化的髖關節(jié)囊的DKK-1 表達和甲基化狀態(tài)，為AS 病理性成骨機制和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取我院因髖關節(jié)強直需接受髖關節(jié)置換手術、成形術或病損切除術的AS 患者，均符合1984年修訂的紐約診斷標準［11］，此外選擇因外傷致股骨頸骨折（FNF）需行髖關節(jié)置換手術的患者。

1.2 主要試劑及儀器組織DNA 抽提試劑盒（美基生物科技有限公司，廣州）；DNA 甲基化轉化及純化試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，北京）；PCR Master Mix（寶生物工程有限公司，大連）；PCR儀（黑馬醫(yī)學儀器有限公司，珠海）；引物（生工生物公司，上海）；qPCR 試劑盒（invitrogen，美國）；Anti-DKK1 antibody（abcam，美國）；Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（southern biotech，上海）。

1.3 方法

1.3.1 髖關節(jié)囊滑膜組織獲取無菌術中切除AS、FNF 患者髖關節(jié)囊滑膜組織，放置在含有冰袋的保溫桶內(nèi)保存并立即輸送至實驗室，將其放在液氮中保存。

1.3.2 DNA 樣本的亞硫酸鹽轉化與純化依照說明書嚴格進行髖關節(jié)囊滑膜組織的亞硫酸鹽的轉化和純化。

1.3.3 MSP 和鑒定亞硫酸鹽處理過的DNA 模板與M 和U 兩對引物進行PCR 擴增。按照SYBR Green qPCR Super Mix 試劑盒，反應體系為20 μL：PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，處理后的DNA 模板1.0 μL，余用蒸餾水補足。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。制備2%瓊脂糖凝膠，電泳條件為120 V，30 min，在凝膠圖像成像系統(tǒng)觀察電泳結果。引物序列和大小見表1-2。

表1 DKK-1 引物序列和片段大小Tab.1 Primer sequence and fragment size of DKK-1

1.3.4 qPCR 檢測DNMTs 的表達總RNA 完整性檢測以及反應過程操作參照試劑盒流程。

1.3.5 Western Blot 檢測DKK-1 表達總蛋白提取和實驗步驟按常規(guī)進行。采用合適的稀釋濃度的抗DKK-1 和內(nèi)參蛋白抗β-actin 進行檢測。使用ECL顯影，條帶結果利用Image J 8.0 軟件分析結果。

表2 DNMTs、18s 引物序列Tab.2 Primer sequence DNMTs and 18s

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，比較行獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western Blot 檢測DKK-1 表達與FNF 組相比，AS 組DKK-1 明顯下調(diào)（P＜0.05）。如圖1。

圖1 DKK-1 表達Fig.1 Expression of DKK-1 protein

2.2 DKK-1 基因啟動子甲基化狀態(tài)比較FNF 組DKK-1 基因均為非甲基化狀態(tài)，而AS 組呈現(xiàn)部分甲基化和完全甲基化狀態(tài)。兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。如圖2。

圖2 DKK-1 基因啟動子甲基化Fig.2 Methylation status of DKK-1 gene promoter

2.3 qPCR 檢測DNMTs 的表達與FNF 組相比，AS 組DNMT1 表達下降，DNMT3A、DNMT3B 表達升高，但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。如圖3。

圖3 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 表達Fig.3 Expressions of DNMT1，DNMT3A and DNMT3B

3 討論

表觀遺傳修飾是調(diào)節(jié)基因表達的重要機制，研究表明DNA 甲基化在AS 的發(fā)生和發(fā)展中扮演著越來越重要的作用［12-14］。但AS 尚無DKK-1 甲基化的研究報道。本文首次檢測了AS 患者的骨化髖關節(jié)囊的DKK-1 和甲基化水平，發(fā)現(xiàn)DKK-1 表達明顯下調(diào)，甲基化水平明顯升高，而DNMTs 表達無明顯差異，提示DKK-1 高甲基化可能參與AS的病理性成骨的進展，對AS 的發(fā)病機制和診療具有重要意義。

本研究中AS 患者骨化的髖關節(jié)囊DKK-1 下調(diào)，這與前期研究［15］和DI 等［16］的發(fā)現(xiàn)一致，提示DKK-1 下調(diào)參與了AS 病理性骨化的進展。檢測DKK-1 甲基化水平，發(fā)現(xiàn)DKK-1 高甲基化，提示DKK-1 下調(diào)可能源于高甲基化。目前大量研究以外周血DKK-1 為主，結果并不一致，表達增高、降低、不變但功能異常均存在，筆者認為主要與病程相關，因為AS 早期可出現(xiàn)溶骨性病變，其與DKK-1 水平升高相關，此外與樣本來源、樣本量、有無治療等相關。該實驗選擇晚期AS 患者為研究對象利于DKK-1 與AS 異位骨化的關聯(lián)。而目前DNA甲基化在疾病的診斷和治療方面已取得進展，如結直腸癌的甲基化檢測試劑盒［17］已上市。同時，去甲基化藥物5-氮雜胞苷早已用于治療白血病、MDS［18］，近期也被投入肺癌、宮頸癌、類風濕關節(jié)炎等疾病的干預性基礎研究［19-21］。因此DKK-1 甲基化可成為AS 的潛在生物標志物和提供新的治療方案。

本研究中AS組與FNF組的DNMTs表達差異無顯著性，提示DKK-1高甲基化可能源于DNMTs功能失調(diào)而非DNMTs表達升高。哺乳動物的靶基因甲基化水平調(diào)節(jié)依賴于DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B，前者維持甲基化，后兩者促進從頭甲基化［22］。XU等［23］發(fā)現(xiàn)AS 患者的血漿DNMT1 mRNA 顯著降低。ASLANI 等［14］發(fā)現(xiàn)AS 患者PBMCs 的DNMT1 下調(diào)且高甲基化，然而與AS 患者的ESR、BASDAI、BASFI等臨床表現(xiàn)無明顯相關性，提示DNMT1可能通過改變其他靶基因甲基化水平參與AS 的發(fā)生發(fā)展。另有研究發(fā)現(xiàn)AS 患者的全血樣本的DNMT mRNA 相對于正常人明顯下降［24］。上述結果均不一致，可能與樣本量、是否接受治療、AS 病程有關，因此仍需AS 骨化組織的DNMTs 的研究來支持筆者的推論。

本文存在部分局限性，一為樣本量少，無法對年齡、性別、炎癥水平、有無藥物治療等因素進行分層分析；二為無干預試驗以驗證5-氮雜胞苷的去甲基化作用是否可逆轉DKK-1 下調(diào)及所致的異位骨化。日后將縱向觀察DKK-1 和DKK-1 甲基化在AS 病情進展的變化，以及5-氮雜胞苷的作用，為AS 提供新的疾病標志物和診療方式。

綜上所述，本研究推斷DKK-1 高甲基化可能參與AS 的病理性骨形成，為AS 的發(fā)病機制、診斷和治療提供新的線索。