連學(xué)輝 肖紅利 鄧江 韓子冀 齊維林

1貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院骨科（貴陽(yáng) 550000）；2遵義市第一人民醫(yī)院骨科（貴州遵義 563000）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱外科常見(jiàn)的創(chuàng)傷，目前尚無(wú)確切的臨床治療方法，SCI及其繼發(fā)性病理生理變化可導(dǎo)致神經(jīng)功能的喪失，具有很高的致殘率和病死率，因此SCI 的治療仍然是個(gè)很棘手的難題［1-2］。近年來(lái)，研究者將基因治療技術(shù)和干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用于治療SCI［3-5］，一方面可以保護(hù)、挽救殘存的神經(jīng)元細(xì)胞；另一方面移植干細(xì)胞的存活、分化和遷移，可促進(jìn)軸突再生并通過(guò)SCI 區(qū)［6］。

人腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（human brain-derived neurotrophic factor，hBDNF）為堿性蛋白質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持正常生理功能起重要作用，還參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)，是一種重要的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子［7］。研究［8-9］顯示，hBDNF 在損傷脊髓的修復(fù)過(guò)程中，具有減輕炎癥反應(yīng)、抗凋亡、保護(hù)感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的作用，可促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生，參與突觸聯(lián)系的形成等。因此，hBDNF 已成為SCI 基因治療首選的目的基因之一。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）來(lái)源于成年人骨髓，屬于非造血組織干細(xì)胞，有多能干細(xì)胞的特點(diǎn)，可向多種中胚層和神經(jīng)外胚層組織細(xì)胞分化［10］。因此，BMSCs 可作為干細(xì)胞移植治療SCI 的理想種子細(xì)胞。

綜上，本研究擬應(yīng)用干細(xì)胞移植技術(shù)聯(lián)合基因治療技術(shù)，將hBDNF 與BMSCs 結(jié)合，構(gòu)建生物活性轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞hBDNF-BMSCs，并在SCI 節(jié)段局部注射移植，探討hBDNF-BMSCs 在損傷大鼠脊髓內(nèi)存活、分化、基因表達(dá)情況及其在損傷脊髓修復(fù)和神經(jīng)功能改善中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及材料重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP（福建省骨科研究所）；雄性SD 大鼠（質(zhì)量100 ～150 g），上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證：SCXK（滬）2007-0005；DMEM/F12 和胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；青鏈霉素（HyClone，美國(guó)）；CCK-8（biosharp，中國(guó)安徽）；DAPI（索萊寶，中國(guó)北京）；Rabbit Anti-hBDNF 和Mouse Anti-rabbit IgG/FITC（博奧森公司，中國(guó)北京）；Rabbit Anti-NeuN/GFAP/p-NF-H/GAP-43，poly-HRP anti-Rabbit IgG（BD，美國(guó)）。

1.1.2 主要儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱（MCO-18AC，Panasonic，日本）；低溫高速離心機(jī)（centrifuge 5424R，Eppendorf，德國(guó)）；透射電子顯微鏡（EM208，PHILIPS，荷蘭）；連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Synergy HTX，Bio Tek，美國(guó)）；CountessⅡFL 全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Thermo，美國(guó)）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（731BR03736，BIO-RAD，美國(guó)）；倒置熒光顯微鏡（IX53，Olympus，日本）；多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（RM6280，中國(guó)成都）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 的提取、培養(yǎng)及擴(kuò)增取成年SD 大鼠1 只，過(guò)度麻醉處死，無(wú)菌取股骨和脛骨，將骨髓沖到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，經(jīng)離心、重懸、淋巴細(xì)胞分離后，用完全培養(yǎng)基重懸，按1 × 104/mL 接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。每天用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞，3 ～4 d 換液1 次，細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶壁2/3 以上時(shí)傳代，按1 × 105個(gè)/瓶進(jìn)行傳代。取第3 代BMSCs 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP 轉(zhuǎn)染BMSCs取第3 代BMSCs，消化、離心、重懸后行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將BMSCs 按5 × 104/孔接種于6 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%匯合時(shí)，分別加入不同感染復(fù)數(shù)的Ad5-hBDNF-EGFP（MOI 分別為10、20、50、100、200）。轉(zhuǎn)染24 h 后更換新的培養(yǎng)基，每天于熒光顯微鏡下觀察，72 h 后提取總蛋白并采用BCA 法定量。

1.2.3 Western blot 法測(cè)定BMSCs 細(xì)胞中hBDNF蛋白的表達(dá)取1.2.2 中提取總蛋白，配制分離膠、濃縮膠，采用煮沸法制備各組待測(cè)樣本及Marker，依次加入各電泳孔。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入hBDNF 一抗（1∶500）及β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，洗滌后，配制HRP超敏發(fā)光液，滴加顯色，放入凝膠成像儀中曝光顯色。

1.2.4 大鼠SCI 模型的建立及分組SD 大鼠96只，隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組、損傷對(duì)照組、空載體-BMSCs 組及hBDNF-BMSCs 組；每組分為4 個(gè)時(shí)相點(diǎn)，即損傷后1、2、4、6 周；每個(gè)時(shí)相點(diǎn)各6 只大鼠。在環(huán)境溫度為（22 ± 2）℃，濕度為（55 ± 5）%的條件下飼養(yǎng)。保持室內(nèi)通風(fēng)良好，實(shí)驗(yàn)前預(yù)飼養(yǎng)1 周使其適應(yīng)環(huán)境。本研究遵循美國(guó)科學(xué)院頒布的第八版實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南，并且經(jīng)過(guò)貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

采用改良Allen 重物打擊法建立SCI 模型［11］，使用直徑2 mm 的無(wú)菌塑料墊片，將其放在脊髓胸10 節(jié)段，用質(zhì)量為10 g 的無(wú)菌砝碼由高5 cm 處落下打擊墊片，導(dǎo)致胸10 節(jié)段SCI。模型構(gòu)建成功表現(xiàn)：砝碼撞擊脊髓時(shí)，大鼠軀體出現(xiàn)抖動(dòng)，雙下肢出現(xiàn)回縮撲動(dòng)，此后表現(xiàn)為遲緩性癱瘓，尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)后，呈癱瘓狀；損傷局部脊髓表面瘀血青紫，術(shù)后雙下肢出現(xiàn)完全性癱瘓。模型構(gòu)建成功后，每天擠壓大鼠膀胱促進(jìn)排尿2 次，持續(xù)7 d。假手術(shù)組手術(shù)切口及入路相同，僅暴露胸10 節(jié)段脊髓。

1.2.5 hBDNF-BMSCs 和空載體-BMSCs 懸液的制備選取轉(zhuǎn)染最成功的hBDNF-BMSCs 和空載體-BMSCs，消化、離心、重懸后，PBS 洗滌2 次，用PBS 重懸后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 106/mL備用。

1.2.6 大鼠SCI 處hBDNF-BMSCs 局部移植大鼠SCI 模型建立7 d 后行局部注射移植，操作如下：常規(guī)麻醉、消毒、鋪巾后，取原皮膚切口，完全暴露胸10 節(jié)段脊髓，用10 μL 的玻璃微管注射器，以胸10 節(jié)段為注射部位，多點(diǎn)注射，每點(diǎn)注射0.5 μL，共2 μL，注射速度0.1 μL/min；同前方法行空載體-BMSCs 組局部注射；損傷對(duì)照組局部注射PBS 2 μL；假手術(shù)組同法顯露胸10 節(jié)段，不作任何注射。移植后每天擠壓大鼠膀胱促進(jìn)排尿2 次，至大鼠能自行排尿?yàn)橹埂?/p>

1.2.7 大鼠的行為學(xué)變化采用BBB 評(píng)分法標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠SCI 后神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)判［12］，各組大鼠分別在建模后24 h 和移植后第1、2、4、6 周時(shí)評(píng)分，觀察大鼠的行為學(xué)變化。評(píng)判時(shí)將大鼠放在直徑為1.5 m 的平面光滑場(chǎng)地自主活動(dòng)5 min，由兩名未參與移植手術(shù)的研究員觀察并記錄大鼠前后肢體運(yùn)動(dòng)的情況，并進(jìn)行綜合評(píng)分。

1.2.8 大鼠皮層體感誘發(fā)電位（cortical somatosensory evoked potentials，CSEP）的變化10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）行腹腔內(nèi)注射麻醉。用腦脊髓立體定位儀固定大鼠頭部，在顱骨正中矢狀線旁開(kāi)約3 mm 及冠狀線旁開(kāi)約1.5 mm 處鉆一直徑約為3 mm 的圓孔，顯露出硬腦膜，用直徑為2 mm的銀球引導(dǎo)電極置入圓孔，接觸硬腦膜，用于大鼠CSEP 的記錄，將銀針參考電極置于皮膚切口處。于對(duì)側(cè)下肢外側(cè)游離出坐骨神經(jīng)，安置雙極鉤狀刺激電極于坐骨神經(jīng)上。刺激后收集并記錄電位變化，刺激參數(shù)：刺激強(qiáng)度為7.5 V、波寬1.6 ms 的單方波，平均疊加100 次。分析參數(shù)：時(shí)間常數(shù)為0.02 s、靈敏度為500 μV，濾波頻率為100 Hz。

1.2.9 大鼠脊髓組織標(biāo)本的獲取與制備各組大鼠在各時(shí)相點(diǎn)用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）行腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，活體下完整切取實(shí)驗(yàn)區(qū)脊髓，分別用作電鏡檢測(cè)、液氮保存、連續(xù)冰凍切片。各時(shí)相點(diǎn)其余大鼠用多聚甲醛經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注固定24 h 后切取試驗(yàn)區(qū)脊髓，脊髓取出后常規(guī)甲醛固定、脫水及石蠟包埋。

1.2.10 各組大鼠損傷脊髓組織形態(tài)學(xué)觀察取移植治療6 周后的各組大鼠脊髓石蠟標(biāo)本切片（層厚5 μm），制成病理切片，將切片脫蠟、水化，HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠損傷脊髓組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.11 各組大鼠損傷脊髓組織的超微結(jié)構(gòu)變化取移植6 周后各組脊髓組織，用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1 mol/L PBS（pH7.2），4 ℃條件下固定2 h；0.1 mol/L PBS（pH 7.2）漂洗3 次；再用1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀，4 ℃條件下固定2 h，漂洗3 次；進(jìn)行梯度乙醇-丙酮脫水，以無(wú)水丙酮+環(huán)氧樹(shù)脂618 包埋劑包埋、聚合；最后用超薄切片機(jī)切取70 ～80 nm 的切片；用醋酸鈾、檸檬酸鉛進(jìn)行染色5 min，在透射電鏡（TEM）下觀察各組大鼠脊髓組織的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.12 大鼠損傷節(jié)段脊髓中hBDNF 的表達(dá)取移植6 周后損傷對(duì)照組（Con-1）、空載體-BMSCs（Con-2）和hBDNF-BMSCs 組移植后（第1、2、4、6周）的大鼠實(shí)驗(yàn)區(qū)脊髓約50 mg，提取總蛋白，采用BCA 法測(cè)定濃度，檢測(cè)BDNF 表達(dá)水平。

1.2.13 各組大鼠損傷脊髓組織NeuN、GFAP、p-NF-H、GAP-43 的變化取移植6 周后各組脊髓組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片（層厚5 μm），制成病理切片，常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，以3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。分別加入兔抗大鼠NeuN、GFAP、p-NF-H、GAP-43 一抗，室溫孵育2 h，PBS 沖洗后滴加試劑1（Polymer Helper），常溫孵育20 min，PBS 洗滌后滴加反應(yīng)試劑2（poly-HRP anti-Rabbit IgG），常溫孵育20 min，PBS 洗滌。將現(xiàn)配好的DAB 溶液滴加標(biāo)本，常溫顯色時(shí)間為5 min，在顯微鏡下觀察顯色充分后，自來(lái)水洗滌終止反應(yīng)。最后采用蘇木紫復(fù)染組織后，采用中性樹(shù)膠封片、顯微鏡觀察，以PBS代替一抗設(shè)置陰性對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于正態(tài)分布、方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hBDNF-BMSCs 構(gòu)建及hBDNF 表達(dá)水平采用大鼠骨髓成功提取并培養(yǎng)高純度BMSCs，并通過(guò)重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP 轉(zhuǎn)染BMSCs 獲得hBDNF-BMSCs，并且隨著MOI 的 增加，hBDNF 的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)MOI = 100 時(shí)，hBDNF 表達(dá)達(dá)到峰值（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 不同MOI Ad-hBDNF-EGFP 轉(zhuǎn)染后BMSCs 中hBDNF的表達(dá)水平Fig.1 The expression level of hBDNF in BMSCs transfectedwith different MOI Ad-hBDNF-EGFP

2.2 hBDNF-BMSCs 局部移植治療大鼠SCI

2.2.1 hBDNF-BMSCs 移植后大鼠的行為學(xué)變化移植治療后6 周，hBDNF-BMSCs 組、空載體-BMSCs 組及損傷對(duì)照組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能均有不同程度的恢復(fù)；其中，hBDNF-BMSCs 組恢復(fù)最快，空載體-BMSCs 組其次，損傷對(duì)照組運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較慢（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 移植后6 周各組大鼠行為能力BBB 評(píng)分Tab.1 BBB scores of behavioral ability of rats in each group 6 weeks after transplantation ±s，分

表1 移植后6 周各組大鼠行為能力BBB 評(píng)分Tab.1 BBB scores of behavioral ability of rats in each group 6 weeks after transplantation ±s，分

注：*與假手術(shù)組相比，#與損傷對(duì)照組相比，&與空載體-BMSCs組相比，P ＜0.05

損傷后24 h移植后1 周移植后2 周移植后4 周假手術(shù)組20.57±3.82 19.67±1.95 20.55±2.26 20.40±2.61損傷對(duì)照組1.80±0.22*5.28±0.90*6.44±1.41*8.60±1.49*空載體-BMSCs 組1.74±0.24*6.38±0.88 6.59±1.16*11.25±1.86*hBDNF-BMSCs 組1.72±0.15*6.68±0.73*9.81±1.95*#17.13±2.51#&

2.2.2 大鼠CSEP 的變化假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)均可記錄到下肢CSEP 的P1波和N1波，hBDNF-BMSCs 組在損傷后24 h 及移植治療后1、2 周，損傷對(duì)照組和空載體-BMSCs 組在損傷后24 h 及移植治療后1、2、4 周，均記錄不到CSEP。hBDNF-BMSCs組在移植治療后4 周可記錄到CSEP，但P1波潛伏期明顯延長(zhǎng)、P1-N1波幅小。在移植治療后6周，各組均可記錄到CSEP，與損傷對(duì)照組和空載體-BMSCs組相比，hBDNF-BMSCs 組大鼠CSEP 的P1波潛伏期明顯縮短、P1-N1波幅顯著加大（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 治療6 周后各組大鼠CSEP 變化Tab.2 Changes of CSEP in rats of each group after 6 weeks treatment ±s

表2 治療6 周后各組大鼠CSEP 變化Tab.2 Changes of CSEP in rats of each group after 6 weeks treatment ±s

注：與假手術(shù)組比，*P ＜0.05，△P ＜0.01 ；與損傷對(duì)照組比，#P ＜0.05；與空載體-rMSCs 組比，&P ＜0.05

組別假手術(shù)組損傷對(duì)照組空載體-BMSCs 組hBDNF-BMSCs 組P1 波潛伏期（ms）8.84±1.59 30.32±3.40△13.65±1.08*10.61±2.09#&P1-N1波幅（μV）306.88±53.10 53.10±6.97△114.34±15.03△#228.64±18.25*#&

2.2.3 大鼠損傷脊髓組織形態(tài)學(xué)觀察移植治療6 周后各組脊髓組織HE 染色及TEM 顯示：假手術(shù)組脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)清晰，脊髓灰質(zhì)見(jiàn)較多神經(jīng)元細(xì)胞，呈多形性，胞質(zhì)染色均勻，可見(jiàn)細(xì)胞核和核仁，胞膜完整，胞漿內(nèi)見(jiàn)較多結(jié)構(gòu)完整的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基復(fù)合體、糖原、核糖體等細(xì)胞器；損傷對(duì)照組組織結(jié)構(gòu)疏松、紊亂，可見(jiàn)明顯的結(jié)構(gòu)空白區(qū)，并見(jiàn)較明顯的膠質(zhì)瘢痕形成，脊髓灰質(zhì)中神經(jīng)元細(xì)胞較少，胞膜不完整，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)溶解，胞漿內(nèi)線粒體腫脹，部分細(xì)胞器崩解；空載體-BMSCs 組組織結(jié)構(gòu)較損傷對(duì)照組清晰，壞死區(qū)及膠質(zhì)瘢痕較少，脊髓灰質(zhì)中可見(jiàn)較少量神經(jīng)元細(xì)胞，形態(tài)及結(jié)構(gòu)較規(guī)則，胞膜完整，細(xì)胞核大，核仁可見(jiàn)，胞漿內(nèi)可見(jiàn)較完整的各種細(xì)胞器；hBDNF-BMSCs 組組織結(jié)構(gòu)較清晰，壞死區(qū)較小，膠質(zhì)瘢痕少，脊髓灰質(zhì)中可見(jiàn)較多神經(jīng)元細(xì)胞，形態(tài)及結(jié)構(gòu)較規(guī)整，胞膜完整，細(xì)胞核大，核仁可見(jiàn)，胞漿內(nèi)見(jiàn)較多結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器，見(jiàn)圖2-3。

圖2 移植治療6 周后各組大鼠損傷脊髓組織形態(tài)學(xué)變化（HE×40）Fig.2 The morphological changes of the injured spinal cord.of rats in each group after 6 weeks transplantation treatment（HE×40）

圖3 TEM 下觀察移植治療6 周后各組損傷脊髓組織超微結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Observation of the ultrastructural changes of injured spinal cord tissue in each group after 6 weeks of transplantation under transmission electron microscope

2.2.4 大鼠損傷節(jié)段脊髓中hBDNF的表達(dá)水平與對(duì)照組相比，移植后1 周時(shí)hBDNF 表達(dá)水平最高，隨時(shí)間延長(zhǎng)，hBDNF 的表達(dá)逐漸趨于穩(wěn)定，6 周后仍可見(jiàn)明顯的hBDNF 表達(dá)；損傷對(duì)照組和空載體-BMSCs 組損傷脊髓節(jié)段均未能檢測(cè)到明顯的hBDNF 的表達(dá)，見(jiàn)圖4。

圖4 hBDNF-BMSCs 移植后各組大鼠損傷脊髓節(jié)段中hBDNF 表達(dá)變化Fig.4 Changes in hBDNF expression in injured spinal cord segments of rats in each group after hBDNF-BMSCs transplantation

2.2.5 NeuN 的表達(dá)情況各組脊髓灰質(zhì)前角均可見(jiàn)NeuN 陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元，胞核深染，成棕褐色，核仁可見(jiàn)。與損傷對(duì)照組和空載體-BMSCs 組比較，hBDNF-BMSCs 移植組NeuN 陽(yáng)性表達(dá)明顯增高（P＜0.05），見(jiàn)表3 及圖5。

表3 各組大鼠損傷脊髓組織每高倍鏡視野中NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)Tab.3 The expression of NeuN positive cells in each high-power field of the injured spinal cord tissue of each group of rats ±s

表3 各組大鼠損傷脊髓組織每高倍鏡視野中NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)Tab.3 The expression of NeuN positive cells in each high-power field of the injured spinal cord tissue of each group of rats ±s

注：*與假手術(shù)組比，#與損傷對(duì)照組比，&與空載體-BMSCs 組比，P ＜0.05

組別假手術(shù)組損傷對(duì)照組空載體-BMSCs 組hBDNF-BMSCs 組細(xì)胞數(shù)11.25±3.3 5.50±2.08*6.25±2.21*10.25±3.40#&

圖5 移植治療后6 周各組大鼠損傷脊髓組織NeuN 的表達(dá)情況（×200）Fig.5 The expression of NeuN in injured spinal cord tissue of rats in each group at 6 weeks after transplantation（×200）

2.2.6 GFAP 的表達(dá)情況各組均可見(jiàn)GFAP 陽(yáng)性表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，損傷對(duì)照組脊髓組織GFAP 陽(yáng)性表達(dá)最高，空載體-BMSCs 組次之。與損傷對(duì)照組和空載體-BMSCs 組比較，假手術(shù)組和hBDNF-BMSCs 組脊髓組織的GFAP 陽(yáng)性表達(dá)明顯減少，hBDNF-BMSCs 組和假手術(shù)組之間無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖6。

圖6 移植治療后6 周各組大鼠損傷脊髓組織GFAP 的表達(dá)情況（×200）Fig.6 The expression of GFAP in injured spinal cord tissue of rats in each group at 6 weeks after transplantation（×200）

2.2.7 p-NF-H 的表達(dá)情況各組SCI 節(jié)段縱切片免疫組化染色均可見(jiàn)p-NF-H 表達(dá)陽(yáng)性的棕褐色纖維。hBDNF-BMSCs 組可見(jiàn)大量表達(dá)，纖維較長(zhǎng)且粗大，多呈縱向排列，與脊髓長(zhǎng)軸平行，其表達(dá)及排列明顯優(yōu)于損傷對(duì)照組及空載體-BMSCs 組，但低于假手術(shù)組，見(jiàn)圖7。

圖7 移植治療后6 周各組大鼠損傷脊髓組織p-NF-H 的表達(dá)情況（×200）Fig.7 The expression of p-NF-H in injured spinal cord tissue of rats in each group at 6 weeks after transplantation（×200）

2.2.8 GAP-43 的表達(dá)情況各組SCI 節(jié)段縱切片免疫組化染色均可見(jiàn)GAP-43 表達(dá)陽(yáng)性的棕褐色纖維。hBDNF-BMSCs 組可見(jiàn)大量GAP-43 表達(dá)，纖維較長(zhǎng)且粗大，排列較整齊，與脊髓長(zhǎng)軸平行，部分交織成網(wǎng)狀，其表達(dá)及排列明顯優(yōu)于損傷對(duì)照組及空載體-BMSCs 組，見(jiàn)圖8。

圖8 移植治療后6 周各組大鼠損傷脊髓組織GAP-43 的表達(dá)情況（×200）Fig.8 The expression of GAP-43 in injured spinal cord tissue of rats in each group at 6 weeks after transplantation（×200）

3 討論

目前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示BDNF 在損傷脊髓的修復(fù)過(guò)程中，具有減輕炎癥反應(yīng)、抗凋亡、保護(hù)感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的作用，可促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生［13］。BDNF 不僅具有誘導(dǎo)神經(jīng)突起定向生長(zhǎng)、決定感覺(jué)及交感神經(jīng)纖維生長(zhǎng)方向等作用，研究顯示BDNF 還有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的營(yíng)養(yǎng)活性，可保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，使其在SCI 后仍能存活［14］。MSCs 來(lái)源豐富，獲取方便，體外培養(yǎng)擴(kuò)增快速，具有多向分化潛能，在宿主組織中可長(zhǎng)期生存并進(jìn)行整合，可采用自體MSCs 進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增并移植，可避免組織配型、免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題［15］。因此，采用自體MSCs 體外培養(yǎng)并移植治療SCI 的方式，引起了廣大SCI 修復(fù)研究者的關(guān)注。研究顯示，SCI 后在損傷部位移植MSCs，MSCs 可在局部長(zhǎng)期存活，并且與損傷脊髓組織整合良好，可促進(jìn)SCI 修復(fù)，從而可改善SCI后的肢體功能［16］。

本研究成功提取、分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增獲得BMSCs，并將重組腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP 成功地轉(zhuǎn)染第3 代大鼠BMSCs，結(jié)果顯示BMSCs 的轉(zhuǎn)染率及轉(zhuǎn)染后hBDNF的表達(dá)水平呈MOI濃度依賴性和時(shí)相性，并對(duì)BMSCs細(xì)胞增值能力無(wú)明顯影響，成功獲取高表達(dá)hBDNF的hBDNF-BMSCs基因工程干細(xì)胞。

將hBDNF-BMSCs 局部注射移植治療SCI，結(jié)果顯示，與對(duì)照組和空載體-BMSCs 組相比，hBDNFBMSCs組大鼠神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)均明顯改善：（1）BBB評(píng)分較移植前明顯提高，大鼠行為能力明顯改善；（2）CSEP 的P1波潛伏期明顯縮短、P1-N1波幅大，脊髓神經(jīng)傳導(dǎo)功能明顯改善；（3）各時(shí)相點(diǎn)均損傷脊髓中均可見(jiàn)BNDF 陽(yáng)性表達(dá)，局部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)與保護(hù)功能持續(xù)存在；（4）損傷脊髓組織中脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)較清晰，壞死區(qū)較小，膠質(zhì)疤痕少，脊髓灰質(zhì)中細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核和核仁均清晰可見(jiàn)；（5）透射電鏡下觀察脊髓灰質(zhì)，見(jiàn)大部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞器數(shù)量及形態(tài)均接近正常；（6）NeuN表達(dá)明顯增多，GFAP 表達(dá)明顯減少，提示hBDNFBMSCs 局部移植后可持續(xù)穩(wěn)定地分泌BDNF，從而保護(hù)殘留神經(jīng)元存活并促進(jìn)移植的BMSCs 轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，并且可使膠質(zhì)反應(yīng)和膠質(zhì)疤痕形成減少；p-NF-H、GAP-43 表達(dá)均明顯增加并排列規(guī)整，提示大量軸突再生并延長(zhǎng)通過(guò)SCI區(qū)。

綜上表明，攜帶外源性hBDNF 目的基因的hBDNF-BMSCs 基因工程干細(xì)胞局部注射移植治療大鼠SCI，可保護(hù)、挽救神經(jīng)元細(xì)胞，減輕神經(jīng)元細(xì)胞的損傷和凋亡，促進(jìn)移植干細(xì)胞的存活和向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，以及促進(jìn)神經(jīng)軸突再生并通過(guò)SCI 區(qū)域，進(jìn)而促進(jìn)大鼠損傷脊髓修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)。其機(jī)制可能包括：（1）BMSCs 分化為神經(jīng)細(xì)胞，從結(jié)構(gòu)上修復(fù)SCI，再通受損的神經(jīng)通路；（2）構(gòu)建并維持抑制膠質(zhì)細(xì)胞再生和膠質(zhì)反應(yīng)的微環(huán)境，減少膠質(zhì)疤痕形成及炎性反應(yīng)，利于軸突再生及通過(guò)損傷區(qū)；（3）hBDNF-BMSCs的營(yíng)養(yǎng)支持作用：分泌損傷修復(fù)因子，如BDNF、NGF、VEGF 等，可保護(hù)神經(jīng)并促進(jìn)神經(jīng)周圍微血管再生，促進(jìn)損傷脊髓血管新生、神經(jīng)再生和損傷脊髓重構(gòu)。

此外，本研究亦存在不足之處。本研究旨在研究“hBDNF-BMSCs 局部移植對(duì)大鼠SCI 的修復(fù)效果”，對(duì)hBDNF-BMSCs 移植后在大鼠SCI 中所發(fā)揮的功能機(jī)制，如分泌功能、修復(fù)功能、保護(hù)機(jī)制及趨化效應(yīng)等，未行進(jìn)一步的研究及分析，本課題組在后續(xù)研究中，將對(duì)上述功能進(jìn)行深入研究，以明確其在SCI 中的修復(fù)機(jī)制。

綜上，本研究顯示hBDNF-BMSCs 局部注射移植治療SCI，可在局部持續(xù)穩(wěn)定分泌hBDNF，保護(hù)神經(jīng)元存活并促進(jìn)移植的BMSCs 轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，在損傷局部形成大量NeuN 表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元，減少膠質(zhì)反應(yīng)和膠質(zhì)疤痕的形成，促進(jìn)軸突再生并延長(zhǎng)通過(guò)SCI 區(qū)，從而促進(jìn)大鼠損傷SCI 后的修復(fù)。本研究展現(xiàn)了干細(xì)胞和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的雙重治療作用，可加快損傷脊髓神經(jīng)結(jié)構(gòu)的修復(fù)及神經(jīng)功能的恢復(fù)，為SCI 的再生及修復(fù)研究提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。