李婷 路志國 邢欣然 尹荷晴 李美港 魯瑤 杜勇

1寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院（銀川 750003）；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院小兒外科（銀川 750003）

下丘腦是能量代謝中樞，高脂飲食（HFD）會刺激下丘腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和酸性纖維蛋白增加［1］。發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲肌肉表達(dá)物3（Mex3c）雜合小鼠可以通過降低食欲和增加活動量導(dǎo)致機(jī)體形成負(fù)能量狀態(tài)［2］；研究表明Mex3c+/-小鼠的腎小球存在固縮現(xiàn)象，但其纖維化程度低［3］，高脂飲食的腎臟功能損傷、纖維化、且尿激酶纖溶酶原激活劑下降和濾過率降低［4］。本研究旨在探討不同能量狀態(tài)誘導(dǎo)的瘦素（leptin）蛋白在腎小管細(xì)胞中的表達(dá)作用，特別是Mex3c 對腎臟組織及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗動物FVB/N雌鼠18只，包括采用CRISPR/Cas9［5］技術(shù)構(gòu)建Mex3c 小鼠6 只。對照組（普通飼料，n=6）、Mex3c 組（普通飼料，n=6）、高脂飲食組（HFD 組；高脂飼料，n=6）。

1.2 試劑AxyPrep總RNA小量制備試劑盒、cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金），全蛋白提取試劑盒（凱基生物），leptin 抗體、瘦素受體（leptin receptor，LEPR）抗體（Abcam），兔二步法檢測試劑盒、β-actin 抗體、DAB顯色試劑盒（中杉金橋），ECL（Advansta 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 一般指標(biāo)和標(biāo)本采集從4 周齡起測定體質(zhì)量（禁食水8 h）、進(jìn)水量、進(jìn)食量。在14 周齡時腹部注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，留取血清；獲取實驗標(biāo)本。

1.3.2 光鏡觀察取小鼠肝臟、脂肪及腎組織制成的4 μm 石蠟切片，蘇木素伊紅染色后并在光鏡顯微鏡下觀察組織形態(tài)。按免疫組化兩步法檢測腎組織leptin、LEPR 蛋白表達(dá)，分析其光密度值。

1.3.3 蛋白印跡實驗取40 mg腎組織，提取蛋白并測蛋白濃度；按照蛋白印跡實驗步驟，獲取蛋白條帶；分別孵育β-actin（1∶5 000）、leptin（1∶3 000）、LEPR（1∶2 000）、4 ℃過夜，常溫孵育二抗1 h（1∶10 000），ECL顯色曝光，經(jīng)Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.3.4 mRNA 提取盒cDNA 轉(zhuǎn)錄取40 mg 的腎臟組織，提取RNA，根據(jù)qPCR 試劑盒獲取cDNA；反應(yīng)條件42 ℃孵育15 min，85 ℃加熱5 s。引物序列LEPR：正義鏈5′-CGTGGTCAGAAGATGTGG-3′，反義鏈5′-CAGGAAAGGATGACAGC-3′；leptin 正義鏈5′-TGTTCAAGCAGTGCCTATCC-3′，反義鏈5′-GGACCTGTTGATAGACTGCCA-3′。

1.3.5 酶標(biāo)儀法檢測甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）及LEPR 和肌酐。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量數(shù)據(jù)以（）形式表示并采用單因素方差分析和t檢驗；HDL/LDL/TG 為偏態(tài)分布采用Kruskal-WallisH檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況三組小鼠在14 周齡體質(zhì)量：對照組（17.93±0.93）g、Mex3c組（15.40±0.10）g、HFD組（22.50 ± 0.95）g；與對照組體質(zhì)量相比，HFD 組高（P＜0.001），Mex3c 組低（P＜0.05）。與對照組進(jìn)食量（5.03±1.04）g/d/只相比，HFD組小鼠的進(jìn)食量多（6.59±1.36）g/d/只（P＜0.05），Mex3c組小鼠的進(jìn)食量為（5.05±0.83）g/d/只（P＞0.05）；三組小鼠進(jìn)水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組TG［（2.98±0.30）mmol/L］相比，Mex3c組TG水平較低［（2.19±0.43）mmol/L］、HFD 組TG 水平較高［（7.18 ± 1.26）mmol/L］（均P＜0.05）；與對照組HDL［（3.09 ± 1.05）mmol/L］相比，Mex3c 組HDL［（2.44 ± 0.18）mmol/L］低表達(dá)（P＞0.05）、HFD 組［（1.01 ± 0.09）mmol/L］低表達(dá)（P＜0.05）；與對照組LDL［（0.38 ± 0.14）mmol/L］相比，Mex3c組LDL低表達(dá)［（0.15±0.07）mmol/L］，HFD組LDL高表達(dá)［（1.08±0.05）mmol/L］（均P＜0.05）。

2.2 病理學(xué)染色與對照組相比，Mex3c 組的肝細(xì)胞排列整齊、空泡狀和HFD 組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、大量空泡狀。對照組和Mex3c 組脂肪細(xì)胞排列緊密、結(jié)構(gòu)完整；但HFD 組細(xì)胞大且融合。與對照組相比，Mex3c 組和HFD 組中的腎小球與包囊之間的空隙變大，腎小管上皮細(xì)胞之間存在間斷，不完整。見圖1-3。

圖1 三組小鼠肝臟組織HE 染色（×40）Fig.1 Hematoxylin and eosin staining in mice liver tissue of three groups（×40）

圖2 三組小鼠腹部脂肪組織HE 染色（40×）Fig.2 Hematoxylin and eosin staining in mice abdome fat tissue of three groups（40×）

圖3 三組小鼠腎臟組織HE 染色（40×）Fig.3 Hematoxylin and eosin staining in mice renal tissue of three groups（40×）

2.3 小鼠血清瘦素受體濃度與對照組［（1 971.70± 661.23）pg/mL］相比，Mex3c 組血清瘦素受體［（1 883.30±718.156）pg/mL］低表達(dá)（P=0.884），HFD組血清瘦素受體［（7 829.20 ± 1 985.41）pg/mL］高表達(dá)（P＜0.01）。

2.4 小鼠腎臟組織中l(wèi)eptin、LEPR 的mRNA 相對表達(dá)量在正常腎臟組織中未檢測到leptin 的表達(dá)，與對照組相比，Mex3c 組（2.34 ± 0.36）高表達(dá)，HFD 組（2.61 ± 0.28）高表達(dá)（均P＜0.01）。與對照組的LEPR mRNA（1.02±0.01）相比，Mex3c 組（0.49 ± 0.23）和HFD 組（0.10 ± 0.03）均低表達(dá)（均P＜0.01）。

2.5 小鼠腎臟組織中l(wèi)eptin、LEPR 蛋白表達(dá)leptin 及LEPR 表達(dá)在腎小管細(xì)胞膜上呈棕黃色，見圖4A；與對照組的leptin（0.15±0.04）相比，Mex3c組（0.19 ± 0.04，P＜0.01）和HFD 組均高表達(dá)（0.29±0.07，P＜0.001）。而LEPR 表達(dá)趨勢與leptin 相反（P＜0.01）。與對照組LEPR 蛋白（0.31 ± 0.12）相比，Mex3c 組（0.19±0.06）和HFD組（0.13±0.05）均低表達(dá)（均P＜0.05），見圖4B。

圖4 三組小鼠腎臟組織中l(wèi)eptin、LEPR 蛋白表達(dá)情況Fig.4 The expression of leptin、LEPR protein in mice rend tissue of three group

2.6 小鼠血清中肌酐水平比較與對照組［（57.91±16.33）mmol/L］相比，Mex3c 組肌酐水平［（29.14±5.71）mmol/L］較低（P＜0.001），HFD 組肌酐水平［（124.73±18.54）mmol/L］較高（P＜0.001）。

3 討論

Mex3c是含有泛素E3連接酶的RNA結(jié)合區(qū)域，在RNA 結(jié)構(gòu)域的C 端［6］，且有兩個hnRNP K 同源性結(jié)構(gòu)域。Mex3c小鼠可降低食欲和增加自身活動量達(dá)到負(fù)能量狀態(tài)，抵抗食物誘導(dǎo)的肥胖［7］。POETSCH等［8］發(fā)現(xiàn)肥胖或者心血管系統(tǒng)疾病中存在leptin抵抗或者leptin 信號通路缺乏是其發(fā)病因素之一。HE 染色顯示Mex3c 組和HFD 組的腎小球存在縮小且腎小管上皮細(xì)胞有斷裂現(xiàn)象，提示能量失衡影響腎臟結(jié)構(gòu)。與對照組相比，HFD 組肌酐濃度較高，提示腎臟濾過功能下降；而Mex3c 組肌酐濃度較低，推測Mex3c 組小鼠處于負(fù)能量狀態(tài)，影響合成肌酐。

對照組不表達(dá)leptin 的mRNA，低表達(dá)leptin 蛋白，說明腎臟組織的leptin 可能來自其他組織；HFD 組和Mex3c 組高表達(dá)leptin 的mRNA 和leptin蛋白，提示腎臟受損可能生成leptin 蛋白。CONSIDINE 等［9］發(fā)現(xiàn)血清中l(wèi)eptin 水平與體質(zhì)量指數(shù)、體脂百分比、脂肪質(zhì)量、脂肪細(xì)胞大小成正比，游離脂肪酸、雌激素、TNF-α 或者腎臟清除率受損會刺激分泌［10］。正常腎臟少量表達(dá)leptin，當(dāng)其損傷時表達(dá)增多，特別是血清leptin 水平會逐漸升高產(chǎn)生leptin 抵抗［11］。HFD組血清中高表達(dá)LEPR，當(dāng)血清中l(wèi)eptin 增高時，其受體伴隨改變，GAO 等［12］發(fā)現(xiàn)高脂飲食致使下丘腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生，大量甘油三酯進(jìn)入下丘腦，抑制STAT3通路，誘導(dǎo)瘦素抵抗［13-14］。

研究表明脂代謝障礙在慢性腎臟病進(jìn)程中起重要作用［15］。原型leptin 經(jīng)腎小球濾過并被腎小管吸收降解，脂代謝紊亂誘導(dǎo)leptin 表達(dá)增多，與LEPR的結(jié)合具有高度特異性、飽和性、時間依賴性及可逆性，達(dá)到腎小管降解的最大飽和度，腎臟的功能受損影響leptin排泄，形成惡性循環(huán)。由Mex3c誘導(dǎo)的負(fù)能量平衡，腎臟組織中l(wèi)eptin、LEPR的表達(dá)有差異性；HE 染色中Mex3c 組和HFD 組中的腎小球變小及腎小管細(xì)胞存在斷裂現(xiàn)象。目前對于Mex3c 及l(fā)eptin 的研究還不是很全面。Mex3c 誘導(dǎo)leptin、LEPR的改變與腎小管細(xì)胞存在何種關(guān)系，還需探究。研究發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體可以減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡，改善腎功［18］；將在后續(xù)實驗測量尿蛋白、尿酸、尿素氮等完善實驗，探究Mex3c 基因缺陷對腎臟功能影響。

綜上，Mex3c 可以誘導(dǎo)小鼠腎臟細(xì)胞leptin 表達(dá)，血肌酐降低，腎小球變小，HFD 組血肌酐升高，腎功能損傷；但是否影響到腎臟的內(nèi)分泌、水代謝功能、水電解質(zhì)和酸堿平衡，進(jìn)而影響到機(jī)體的內(nèi)環(huán)境需進(jìn)一步研究。