白文輝 李英 李宗龍

青海紅十字醫(yī)院乳腺外科（西寧 810000）

乳腺癌嚴重威脅女性生命健康，其發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果［1-3］，探究乳腺癌中異常表達的基因及其對該腫瘤發(fā)展的影響，可為其治療提供新策略。circPTPRA是一種在肺癌中表達下調(diào)的環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA），上調(diào)其表達可阻礙肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低小鼠異種移植瘤轉(zhuǎn)移，抑制肺癌發(fā)展進程［4］。然而，circPTPRA 對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響還未知。StarBase生物在線軟件預測顯示，circPTPRA 與miR-556-3p之間可能存在靶向調(diào)控關系。有報道稱，miR-556-3p 在膀胱癌中表達升高，上調(diào)miR-556-3p 可促進膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲和集落形成［5］。但是，miR-556-3p 對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響尚不明確。本研究主要觀察circPTPRA 和miR-556-3p 對乳腺癌細胞MDA-MB-231 增殖、遷移和侵襲的影響及circPTPRA 能否靶向miR-556-3p 發(fā)揮作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2015年10月至2018年5月于本院行手術(shù)治療的41 例乳腺癌患者為研究對象，患者平均年齡（53.26±8.75）歲；TNM 分期Ⅰ期9 例，Ⅱ期17 例，Ⅲ期15 例；依據(jù)病理類型不同分為導管原位癌（8 例）、浸潤性導管癌（28 例）和浸潤性小葉癌（5 例）。納入標準：首次確診；術(shù)前未行任何治療；經(jīng)病理檢查確診。排除標準：同時患有其他腫瘤；自身免疫疾病、血液系統(tǒng)疾病等患者。研究符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 細胞和試劑MDA-MB-231 細胞株，中國科學院上海細胞庫；RPMI 1640 培養(yǎng)基、細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶；胎牛血清，美國Hyclone 公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、circPTPRA 過表達載體（pcDNAcircPTPRA）、空載體（pcDNA）、miR-556-3p 抑制劑（anti-miR-556-3p）和模擬物（mimcs）、抑制劑陰性序列（anti-miR-NC）及模擬對照序列（miR-NC），上海生工；RNA 抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒，大連寶生物；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國Invitrogen 公司。

1.3 方法

1.3.1 實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測circPTPRA 和miR-556-3p 表達充分研磨組織樣本，用RNA 抽提試劑盒提取組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，行PCR 擴增。2-△△Ct法計算circPTPRA、miR-556-3p的表達量。

1.3.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10 %胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基）培養(yǎng)MDA-MB-231 細胞。取6 孔板，接種MDA-MB-231 細胞（1×105個/孔），培養(yǎng)12 h 后，棄培養(yǎng)基。將LipofectamineTM2000 試劑與等體積終濃度為100 nmol/L 的pcDNA（pcDNA 組）、pcDNA-circPTPRA（pcDNA-circPTPRA 組）、anti-miR-NC（anti-miR-NC 組）、antimiR-556-3p（anti-miR-556-3p 組）、pcDNA-circPTPRA 與miR-NC（pcDNA-circPTPRA+miR-NC 組）、或pcDNA-circPTPRA 與miR-556-3p mimics（pcDNAcircPTPRA+miR-556-3p 組）混合均勻，緩慢加至6 孔板中。孵育6 h 后，換為完全培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.3 CCK-8 法檢測細胞增殖取96 孔板，接種各組細胞（1.0×104個/孔）。培養(yǎng)24 h，加10 μL CCK-8。孵育2 h，酶標儀450 nm 處測光密度（OD）值。

1.3.4 Transwell檢測細胞遷移和侵襲遷移實驗：于Transwell 上室接種各組細胞（1.0×104個/室），下室加500 μL 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后，顯微鏡觀察，記數(shù)。侵襲實驗：除預先在Transwell 上室鋪Matrigel基質(zhì)膠外其余步驟同遷移實驗。

1.3.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炗缮虾Ｉじ鶕?jù)StarBase 生物在線軟件預測顯示的circPTPRA 與miR-556-3p 的結(jié)合位點，分別構(gòu)建circPTPRA 野生型熒光素酶載體（WT-circPTPRA）及突變型熒光素酶載體（MUT-circPTPRA）。取6 孔板，接種MDAMB-231 細胞（1×105個/孔），培養(yǎng)12 h 后，棄培養(yǎng)基。將LipofectamineTM2000 試劑與等體積終濃度為100 nmol/L 的WT-circPTPRA 與miR-556-3p mimics、WT-circPTPRA 與miR-NC、MUT-circPTPRA 與miR-556-3p mimics 或MUT-circPTPRA 與miR-NC 混合均勻，緩慢加至6 孔板中。孵育6 h 后，換為完全培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，裂解細胞。將裂解液離心（3 500 r/min、5 min）后，取上清，檢測熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲與海腎的熒光強度比值表示。

1.4 統(tǒng)計學方法SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組間比較用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 circPTPRA 和miR-556-3p 在乳腺癌組織中的表達乳腺癌組織中circPTPRA 表達低于癌旁組織（P＜0.05），miR-556-3p 表達高于癌旁組織（P＜0.05），這說明circPTPRA 在乳腺癌組織中表達上調(diào)，miR-556-3p 表達下調(diào)。見圖1。

圖1 circPTPRA 和miR-556-3p 在乳腺癌組織中的表達Fig.1 The expression of circPTPRA and miR-556-3p in breast cancer tissues

2.2 過表達circPTPRA 抑制乳腺細胞增殖與pcDNA 組比較，pcDNA-circPTPRA 組MDA-MB-231細胞中circPTPRA 表達升高（P＜0.05），OD值降低（P＜0.05），說明過表達circPTPRA 可阻礙MDAMB-231 細胞增殖。見圖2。

圖2 過表達circPTPRA 對MDA-MB-231 細胞增殖的影響Fig.2 The effect of overexpression of circPTPRA on the proliferation of MDA-MB-231 cells

2.3 過表達circPTPRA 抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲與pcDNA 組比較，pcDNA-circPTPRA 組MDAMB-231 細胞遷移和侵襲數(shù)降低（P＜0.05），說明過表達circPTPRA 可阻礙MDA-MB-231 細胞遷移和侵襲。見圖3。

圖3 過表達circPTPRA 對MDA-MB-231 細胞遷移和侵襲的影響Fig.3 The effect of overexpression of circPTPRA on the migration and invasion of MDA-MB-231 cells

2.4 circPTPRA 靶向調(diào)控miR-556-3p 的表達共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circPTPRA 與miR-556-3p mimics 的細胞熒光素酶活性為（0.55±0.05），明顯低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circPTPRA 與miR-NC 的細胞熒光素酶［（1.01±0.08），t=14.628，P＜0.05］；共轉(zhuǎn)染MUT-circPTPRA與miR-556-3p mimics 的細胞熒光素酶活性為（1.02± 0.06），與共轉(zhuǎn)染MUT-circPTPRA 與miR-NC 的細胞熒光素酶比較差異無統(tǒng)計學意義［（1.04±0.04），t=0.832，P=0.418］，說明circPTPRA 可靶向結(jié)合miR-556-3p。pcDNA-circPTPRA組MDA-MB-231細胞中miR-556-3p表達量低于pcDNA組［（0.47±0.04）vs.（1.00±0.04），t=28.107，P＜0.05］，說明過表達circPTPRA 抑制miR-556-3p 表達。

2.5 敲減miR-556-3p 抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲anti-miR-556-3p 組MDAMB-231 細胞中miR-556-3p 表達、細胞OD值、遷移和侵襲數(shù)低于anti-miR-NC 組（P＜0.05），說明敲減miR-556-3p 可阻礙MDA-MB-231 細胞增殖、遷移和侵襲。見圖4。

圖4 敲減miR-556-3p 對MDA-MB-231 細胞增殖、遷移和侵襲的影響Fig.4 The effect of knocking down miR-556-3p on the proliferation，migration and invasion of MDA-MB-231 cells

2.6 過表達miR-556-3p 逆轉(zhuǎn)過表達circPTPRA對乳腺癌MDA-MB-231 細胞增殖、遷移和侵襲的影響pcDNA-circPTPRA+miR-556-3p 組MDA-MB-231 細胞中miR-556-3p 表達、細胞OD值、遷移和侵襲數(shù)均高于pcDNA-circPTPRA+miR-NC 組（P＜0.05），說明過表達miR-556-3p 逆轉(zhuǎn)了過表達circPTPRA 對MDA-MB-231 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。見圖5。

圖5 過表達miR-556-3p 逆轉(zhuǎn)過表達circPTPRA 對MDA-MB-231 細胞增殖、遷移和侵襲的影響Fig.5 Overexpression of miR-556-3p reversed the effect of overexpression of circPTPRA on the proliferation，migration and invasion of MDA-MB-231 cells

3 討論

circRNA 呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且高度保守。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等腫瘤中存在大量異常表達的circRNA，這些circRNA 參與調(diào)控腫瘤細胞惡性表型，為腫瘤治療提供了潛在分子靶點［6-8］。研究已表明，多種circRNA 參與乳腺癌的發(fā)展進程，其中circAHNAK1、circAMOTL1、circNFIC 和circKDM4C等circRNA 在乳腺癌中表達下調(diào)，對乳腺癌發(fā)展起抑制作用［9-12］；circ_0067934、circRNA-CER、circ-MMP11 和circ_100876 等［13-16］在乳腺癌中表達上調(diào)，作為促癌基因促進乳腺癌的發(fā)展進程。作為一種circRNA，circPTPRA 在膀胱癌組織中表達降低，且其低表達與腫瘤分期、腫瘤大小及預后密切相關，上調(diào)其表達可減弱膀胱癌細胞的增殖能力，可作為膀胱癌的預后生物標志物和治療靶標［17］。本研究顯示，乳腺癌組織中circPTPRA 的表達明顯低于癌旁組織，提示circPTPRA 可能在乳腺癌中也發(fā)揮抑癌基因作用；過表達circPTPRA 抑制了乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示circPTPRA也可作為乳腺癌治療的分子靶點。

circRNA 可發(fā)揮miRNA 分子海綿作用調(diào)控miRNA靶基因表達，進而發(fā)揮生物學調(diào)控作用［18-20］。為了探究circPTPRA 影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機制，本研究證實了circPTPRA 可靶向結(jié)合并負調(diào)控miR-556-3p，這與本文結(jié)果中乳腺癌組織中circPTPRA 表達降低而miR-556-3p 表達升高的結(jié)果一致。研究顯示，miR-556-3p 在食管癌組織中呈高表達，且其高表達的患者預后較差，過表達miR-556-3p 阻礙食管癌細胞增殖和侵襲，為食管癌的治療提供了新的治療靶標［21］；miR-556-3p在肺癌中表達下調(diào)，上調(diào)miR-556-3p 可延緩肺癌發(fā)展進程，并增強肺癌細胞對順鉑的敏感性［22］。這提示miR-556-3p 可能在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同。本研究顯示，敲減miR-556-3p可有效阻礙乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，提示miR-556-3p 可能對乳腺癌發(fā)展起促進作用，靶向下調(diào)其表達可抑制乳腺癌的發(fā)展進程；此外，過表達miR-556-3p 降低了過表達circPTPRA 對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，進一步提示circPTPRA 通過靶向抑制miR-556-3p來促進乳腺癌細胞的惡性生物學行為。

綜上所述，乳腺癌組織中circPTPRA表達降低，而miR-556-3p 表達升高；過表達circPTPRA 可阻礙乳腺癌細胞MDA-MB-231 細胞增殖、遷移和侵襲，其作用機制與靶向結(jié)合并負調(diào)控miR-556-3p 表達有關，circPTPRA/miR-556-3p 軸可能為乳腺癌的治療提供了新的靶點。但是，miR-556-3p 下游靶基因及信號通路對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響尚需進一步探究，且需要通過裸鼠移植瘤實驗在體內(nèi)驗證circPTPRA/miR-556-3p 軸在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。