瞿 珍 何鳴鏑 趙 磊 許婷婷

ABO血型系統(tǒng)是于1900年第一種被發(fā)現(xiàn)的人類血型[1]，也是到目前為止最廣為人知、研究最為廣泛、最具臨床意義的血型系統(tǒng)[2]。根據(jù)紅細(xì)胞表面有無A、B抗原及血清中有無抗A、抗B抗體可將ABO血型分為A型、B型、AB型、O型。紅細(xì)胞上A、B抗原的異常表達(dá)會導(dǎo)致ABO亞型的產(chǎn)生。ABO亞型的及時發(fā)現(xiàn)及準(zhǔn)確鑒定是目前ABO血型系統(tǒng)在輸血醫(yī)學(xué)中的主要課題。

按照2019版《血站技術(shù)操作規(guī)程》，獻(xiàn)血前采集血液標(biāo)本進(jìn)行檢測，檢測項(xiàng)目包括血紅蛋白、ALT、ABO血型等，檢測合格方可獻(xiàn)血。同時留取血清學(xué)檢測標(biāo)本管和核酸檢測標(biāo)本管交由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)相關(guān)檢測。近期，筆者用全自動血型分析儀PK7300進(jìn)行血型篩查時發(fā)現(xiàn)一例標(biāo)本，正反鑒定一致為B型，與紙片法初篩血型不一致(AB型)，送本中心輸血研究室鑒定。經(jīng)鑒定試管法血型血清學(xué)為B(A)亞型，正反不一致，后經(jīng)測序證實(shí)為B(A)亞型，PK7300存在亞型漏檢，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

無償獻(xiàn)血者張某某，女，22歲，漢族，未婚，無輸血、妊娠、手術(shù)史。符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：PK7300全自動血型分析系統(tǒng)(美國Beckman公司)；離心機(jī)(日本久保田公司)；高速臺式離心機(jī)(美國Thermo公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；電泳儀(上海天能科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；ABI 9700 PCR儀(美國ABI公司)；ABI 3730 型基因分析儀(美國ABI公司)；nono-100分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.2.2 試劑：單克隆抗-A、抗-B標(biāo)準(zhǔn)血清(批號：102182)，反定紅細(xì)胞(批號：115408c，美國Immucor公司)；單克隆抗-A、抗-B、抗-H標(biāo)準(zhǔn)血清(批號：20201208)，反定紅細(xì)胞，篩選紅細(xì)胞(自制，上海血液生物)；血液基因組DNA柱式小量提取試劑盒(江蘇偉禾生物科技有限公司)；人類ABO血型基因分型檢測試劑盒(PCR-SBT法，江蘇偉禾生物科技有限公司)。

1.3 血型鑒定

1.3.1 紙片法：用兩滴單克隆抗血清和一滴手指血在血型板反應(yīng)圈內(nèi)混勻，觀察結(jié)果。

1.3.2 PK7300全自動血型分析儀法：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[3]，利用全自動加樣功能，正定型血型檢測用25μl標(biāo)準(zhǔn)血清與25μl紅細(xì)胞懸液反應(yīng)，反定型血型檢測用25μl A、B、O 標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液與血漿25μl反應(yīng)。加樣結(jié)束后，30℃孵育、靜置1h，然后血型儀通過CCD 系統(tǒng)圖像數(shù)字化處理后，以判別是否發(fā)生凝集，軟件自動判讀及匯總正反定型結(jié)果。結(jié)果檢測出正反定型均為B型。

1.3.3 試管法：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[4]，對樣本進(jìn)行試管法正反定型鑒定。正定型加兩滴單克隆血清，然后加一滴先證者3%-5%紅細(xì)胞懸液；反定型加兩滴血漿和一滴3%-5%的紅細(xì)胞懸液，混勻后立即離心觀察結(jié)果。

1.3.4 基因測序：采用血液基因組DNA柱式小量提取試劑盒，采用江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司血液基因組試劑盒，對ABO基因第6及7外顯子序列擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為第一步1個循環(huán)，95℃，2min30s，第二步35個循環(huán)，94℃，1s，65℃信號采集點(diǎn)，55s，對PCR產(chǎn)物直接測序。采用 ExoSAP-IT (Thermo) 純化ABO基因、將PCR產(chǎn)物純化,將純化PCR產(chǎn)物用作測序反應(yīng)DNA模板，在ABI 3730型基因分析儀檢測分析，采用Chromas軟件閱讀圖譜，Clone Manager軟件比對和分析測序結(jié)果，將測序結(jié)果與人類紅細(xì)胞血型基因數(shù)據(jù)庫[5]中收錄的基因序列進(jìn)行比對，判斷測序結(jié)果基因型以及是否存在新的 ABO 血型基因多態(tài)性位點(diǎn)。使用的引物和擴(kuò)增條件、測序工作均由江蘇偉禾生物科技有限公司負(fù)責(zé)完成。

2 結(jié) 果

2.1 紙片法結(jié)果

紙片法檢測該獻(xiàn)血者血型為AB型。

2.2 PK7300全自動血型儀血型檢測結(jié)果

PK7300全自動血型儀檢測該獻(xiàn)血者血型正反定型一致，均為B型，見圖1。

圖1 PK7300全自動血型儀血型檢測結(jié)果

2.3 試管法血型檢測結(jié)果

正定型顯示有A、B抗原，單克隆抗A強(qiáng)反應(yīng)，人源抗A弱反應(yīng)；反定型Ac端強(qiáng)反應(yīng)顯示先證者血清中有較強(qiáng)的不規(guī)則抗A抗體。這些血清學(xué)特征符合B(A)的血清學(xué)反應(yīng)格局。

2.4 基因測序檢測結(jié)果

對該標(biāo)本進(jìn)行第 1-7 外顯子直接測序，綜合結(jié)果判定以A101為參考序列，得到結(jié)果如下: 第7外顯子 700C/G (圖1)是較B基因型增加的堿基替換，證實(shí)該獻(xiàn)血者ABO血型的基因型為 B(A).02/O.01.02。見圖2。

圖2 ABO血型基因測序結(jié)果

3 討 論

自1900年，Landstiner發(fā)現(xiàn)人類第一個紅細(xì)胞血型系統(tǒng)以來，ABO血型系統(tǒng)一直是最重要的血型系統(tǒng)，在移植醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、臨床輸血等方面發(fā)揮重要的作用。隨著檢測技術(shù)的不斷提高，越來越多的ABO亞型不斷被發(fā)現(xiàn)，其中B(A)血型是一種非常罕見的ABO亞型，1993年，Yamamoto[6]等首次發(fā)現(xiàn)一種能夠編碼正常糖基轉(zhuǎn)移酶B的ABO等位基因，同時具有A糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，這個等位基因被命名為B(A)01。2012年已經(jīng)報(bào)道的B(A)等位基因有6個[7]，其中B(A)02、B(A)04-06基因型均首先在中國人群中發(fā)現(xiàn)。

表1 獻(xiàn)血者標(biāo)本試管法正反定型結(jié)果

血清學(xué)方法鑒定ABO血型是依據(jù)蘭德斯坦納法則通過檢測抗原和抗體來確定血型，當(dāng)基因突變時有可能會產(chǎn)生ABO亞型，大多數(shù)亞型與蘭德斯坦納法則不完全相符，于是會造成正反定型不相符的情況。不同的亞型具有不同的血清學(xué)反應(yīng)特點(diǎn)，我們依據(jù)這些特點(diǎn)來判斷亞型的類型。B(A)的血清學(xué)反應(yīng)特點(diǎn)有：(1)A抗原較弱，與人源抗-A反應(yīng)弱，但與單克隆抗體反應(yīng)可能會增強(qiáng)；(2)有強(qiáng)反應(yīng)性的不規(guī)則抗-A抗體，反定型Ac端常常呈強(qiáng)陽性。這種情況很容易出現(xiàn)正反定型相符，導(dǎo)致該亞型被漏檢從而誤判為B型。

目前各血站都引進(jìn)不同廠家的全自動血型分析儀進(jìn)行血型檢測，有NEO、PK7300、Metis-200、Microlab STAR IVD等等，不同設(shè)備的方法學(xué)也不盡相同。NEO、Metis采用U型微板法，PK7300采用梯板法。U型微板法樣本和試劑加入微板后通過離心振蕩得到直觀的反應(yīng)結(jié)果，梯板法樣本和試劑往往需要稀釋,反應(yīng)后通過靜置得到反應(yīng)結(jié)果。在本實(shí)驗(yàn)室中，獻(xiàn)血者血型復(fù)檢采用PK7300全自動血型分析儀。按照儀器廠家提供的參數(shù)，市售血型正反定型檢測試劑都需要稀釋，稀釋之后抗體效價會降低，對一些亞型或者弱凝集，正定型檢測因?yàn)榭笰抗B凝集較弱，儀器可能會判定不凝集，反定型檢測因?yàn)楸旧砜贵w較弱或者被稀釋，可能一些弱凝集反應(yīng)不明顯，可能導(dǎo)致儀器檢測出來的血型和實(shí)際的血型不一致，這種情況就會導(dǎo)致亞型漏檢或者血型鑒定錯誤，給輸血安全帶來風(fēng)險。本案例就是由于PK7300對A抗原檢測的漏檢導(dǎo)致血型誤判為B型。曾有血站報(bào)道過使用Galileo全自動血型儀進(jìn)行ABO血型鑒定時確實(shí)也有B(A)亞型漏檢的情況發(fā)生[8]。

為確保輸血安全，準(zhǔn)確鑒定血型具有重要意義。臨床輸血中，我們提倡交叉配血相合性輸注，這類亞型往往會導(dǎo)致交叉配血不和，所有此類血液往往沒有發(fā)往臨床。通過本案例的分析討論，筆者認(rèn)為獻(xiàn)血者的血型檢測，應(yīng)采用高質(zhì)量單克隆抗體檢測試劑，建議采用不同的實(shí)驗(yàn)方法以及不同廠家的試劑復(fù)檢[9]，避免因?qū)嶒?yàn)方法的局限以及單一試劑引起弱的血型抗原漏檢。同時應(yīng)兼顧試劑、人員、檢測方法等，增加技術(shù)培訓(xùn)，提高實(shí)驗(yàn)技能，盡可能避免亞型漏檢，以確保輸血安全。

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