陳軍梅 林 萱

胰腺癌是一種起病隱匿、惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率在全身惡性腫瘤中占比約1%-2%[1]，且近年有逐年升高趨勢(shì)。由于缺乏早期發(fā)現(xiàn)和有效干預(yù),胰腺癌患者5年生存率不足8%[2]，亟需尋找早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物及有效治療靶點(diǎn)以改善預(yù)后。

殺傷性T細(xì)胞來(lái)源的蛋白激酶(T-lymphokine-activated Killer Cell-originated Protein Kinase,TOPK)是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，與果蠅腫瘤抑制蛋白Dlg的人類同源物分子PDZ結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的蛋白激酶--PDZ結(jié)合激酶(PDZ Binding Kinase，PBK)屬同一分子，統(tǒng)稱為PBK/TOPK[3]。TOPK在細(xì)胞周期調(diào)控和有絲分裂中發(fā)揮重要作用,在分化細(xì)胞中的表達(dá)很低，其過(guò)度表達(dá)是許多腫瘤的病理生理學(xué)特征[4]。Hinzman等[5]利用已建立的功能獲得與功能喪失研究和患者來(lái)源的異種移植物--胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系，并檢測(cè)患者的檔案組織樣本，首次證實(shí)PBK/TOPK在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與胰腺癌細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)。本研究通過(guò)免疫組化染色法檢測(cè)TOPK蛋白在70例胰腺癌組織中的表達(dá)，分析不同表達(dá)水平在臨床病理特征分布及與患者生存率和不良預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料和分組

所有患者在術(shù)前均未接受過(guò)放、化療或者生物學(xué)治療，且對(duì)參與的研究均知情同意。組織芯片病理分型診斷參照WHO胰腺腫瘤組織學(xué)分類(2019年第5版)[6]，含導(dǎo)管腺癌、腺泡細(xì)胞癌各32例，粘液性囊腺癌3例，胰母細(xì)胞瘤1例，腺鱗癌1例、神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例，共70例(胰腺癌組)；以及隨機(jī)選取的胰腺癌癌旁正常組織10例(對(duì)照組)，每例1個(gè)組織塊。胰腺癌樣本的病理分級(jí)參照2017歐洲神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤學(xué)會(huì)共識(shí)[7],G1級(jí)14例，G1級(jí)-G2級(jí)4例、G2級(jí)21例，G2級(jí)-G3級(jí)3例、G3級(jí)23例；不能評(píng)估級(jí)別者5例。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)頒布的胰腺癌TNM分期(2018年第8版)[8]，本次胰腺癌樣本的T分期中T1 3例，T2 39例,T3 25例，T4 3例，N分期中N0 55例，N1 15例，M分期中M0期70例；TNM分期中IA期3例，IB期32例，IIA期18例，IIB期14例，III期3例。胰腺癌組病例年齡23-80歲，平均年齡54.4歲，中位年齡54歲；男性42例，女性28例。對(duì)照組年齡23-42歲，平均年齡37.7歲，中位年齡40歲；男性5例，女性5例。

1.2 主要試劑和儀器

胰腺癌組織芯片(貨號(hào)PA804a，生產(chǎn)批次20190329)購(gòu)自西安百思達(dá)生物科技有限公司;小鼠TOPK抗體(圣克魯斯生物技術(shù)上海有限公司，編號(hào)sc-393313)，生物素標(biāo)記的二抗DAKO(安捷倫科技有限公司，編號(hào)K5007)；無(wú)水乙醇(批號(hào)10009218)、二甲苯(批號(hào)10023418)、磷酸鹽緩沖液(批號(hào)KDX05)均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)(無(wú)錫傲銳東源生物科技有限公司，編號(hào)ZL1-9065)、3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)D5637)，蘇木精(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)H9627)。

組織攤片烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)JK-6)，抗原修復(fù)用微波爐(廣東美的電器有限公司，型號(hào)KJ23B(C)-AN)，生物顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)BX53)。

1.3 免疫組化染色和評(píng)分

胰腺癌組織芯片經(jīng)二甲苯脫蠟并梯度乙醇水化、檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)1.5min后在室溫下用過(guò)氧化氫(0.3%)對(duì)內(nèi)源過(guò)氧化物酶失活10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次。用抗TOPK抗體(稀釋度1∶200)室溫孵育1h后加入生物素標(biāo)記的二抗DAKO孵育30min，3,3'-二氨基聯(lián)苯胺室溫染色后蘇木精復(fù)染5min，脫水后透明封片。

TOPK蛋白在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中呈現(xiàn)黃色或棕黃/褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，由兩名病理科副主任以上醫(yī)師判讀。高倍鏡下(×400)每個(gè)樣本計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按其染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分：<5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分值乘積為T(mén)OPK表達(dá)最終結(jié)果：0分為不表達(dá)，1-2分為低表達(dá)，3-6分為中等表達(dá)，>6分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料的比較采用秩和檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法比較組間生存差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺癌組與對(duì)照組TOPK蛋白表達(dá)比較

胰腺癌組TOPK蛋白表達(dá)評(píng)分結(jié)果為：1例不表達(dá)(1.43%)，33例低表達(dá)(47.14%),31例中表達(dá)(44.29%)，5例高表達(dá)(7.14%)；對(duì)照組8例不表達(dá)(80.00%),2例低表達(dá)(20.00%)。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，兩組TOPK蛋白表達(dá)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1，表1。

注：正常胰腺組織導(dǎo)管和腺泡結(jié)構(gòu)規(guī)則，無(wú)TOPK蛋白顯色(A)或僅呈淺黃色(占比<25%，B)。胰腺癌組織導(dǎo)管和腺泡大小不等，結(jié)構(gòu)紊亂，形態(tài)各異，無(wú)TOPK蛋白顯色僅1例(C)，棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞占比<25%(D)、棕褐色陽(yáng)性細(xì)胞占比25%-50%(E)以及棕褐色陽(yáng)性細(xì)胞占比>75%(F)

表1 胰腺癌組與對(duì)照組TOPK蛋白表達(dá)比較(n)

2.2 胰腺癌組不同TOPK蛋白表達(dá)水平患者臨床病理特征分布比較

胰腺癌患者TOPK表達(dá)亞組間不同性別、年齡、T分期、N分期、病理分級(jí)及病理類型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，只有不同TNM分期的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 胰腺癌組不同TOPK蛋白表達(dá)水平的臨床病理特征比較

2.3 不同TOPK表達(dá)水平與胰腺癌患者生存比較

2016-01-2020-01采用電話隨訪70例胰腺癌患者，其中存活9例，死亡61例(均死于胰腺癌)。

Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，TOPK中/高表達(dá)亞組患者平均生存期低于無(wú)/低表達(dá)亞組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 不同TOPK表達(dá)水平胰腺癌患者生存曲線

表3 TOPK無(wú)/低表達(dá)患者與中/高表達(dá)患者生存時(shí)間比較

2.4 胰腺癌患者預(yù)后因素回歸分析

Cox回歸單因素與多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、TOPK蛋白表達(dá)水平為胰腺癌患者的不良預(yù)后因素(P<0.01)。見(jiàn)表4，表5。

表4 影響胰腺癌患者預(yù)后的單因素分析

表5 影響胰腺癌患者預(yù)后的多因素回歸分析

3 討 論

組織芯片又稱組織微陣列，是將數(shù)十個(gè)乃至上千個(gè)組織樣本整齊地排列在同一張載玻片上制成的微縮組織切片,具有體積小、信息量大、操作統(tǒng)一、對(duì)比性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用組織芯片研究胰腺癌組織TOPK蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示TOPK蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常胰腺組織；TNM分期較高的胰腺癌組織，其TOPK蛋白表達(dá)明顯增加。TOPK高表達(dá)患者平均生存期縮短，而且是胰腺癌不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

PBK/TOPK是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，在正常成年男性的睪丸組織表達(dá)最高[9]。TOPK在胃癌[10]、肺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]、急性髓細(xì)胞白血病[13]、膠質(zhì)瘤[14]、甲狀腺癌[15]、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤[16]等多種腫瘤中高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的有絲分裂中起著不可或缺的作用[17]。有Meta分析顯示，在各種癌癥中，PBK/TOPK蛋白高表達(dá)患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存期低，無(wú)病生存期短[18]。PBK/TOPK這種強(qiáng)烈的惡性作用是通過(guò)多環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)的：(1)能強(qiáng)烈促進(jìn)細(xì)胞分裂[19]。PBK/TOPK與細(xì)胞有絲分裂紡錘體的形成相關(guān)[20]，在細(xì)胞有絲分裂期被磷酸化激活，于G2期、M期的表達(dá)上調(diào)，與細(xì)胞周期蛋白B1變化一致，并通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(Cylcin-dependent Kinase 1,CDK1)/Cyclin B1復(fù)合體的表達(dá)，磷酸化多梳抑制復(fù)合物1(Polycomb Repressive Complexes 1，PRC1)，加快細(xì)胞有絲分裂[19]。PBK/TOPK還可結(jié)合抑癌因子p53 的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，抑制下游細(xì)胞周期調(diào)控蛋白功能，導(dǎo)致異常有絲分裂，促進(jìn)腫瘤形成[21]。(2)持續(xù)維持致癌底物的磷酸化，使癌細(xì)胞繞過(guò)調(diào)控檢查點(diǎn)控制，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[22]。(3)調(diào)控或激活PI3K/AKT/ERK1/ERK2 信號(hào)通路[23]、PBK/PTEN 和ERK通路[24]、β-catenin-TCF/LEF[25]等多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)-2、 MMP-9等多種細(xì)胞因子表達(dá)，引起機(jī)體內(nèi)一系列腫瘤基因或轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量發(fā)生變化，提高腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、侵襲、遷移及抗凋亡能力[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)[5]，PBK/TOPK通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，并提高調(diào)控MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子—癌基因cMYC的穩(wěn)定性，加速M(fèi)MP-2、MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，胰腺癌患者TOPK蛋白表達(dá)增強(qiáng)，且與患者生存期及不良預(yù)后有關(guān)，進(jìn)一步豐富了TOPK與胰腺癌關(guān)系的研究結(jié)果，但本研究中無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例，故TOPK蛋白在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胰腺癌組織中的表達(dá)情況尚待繼續(xù)觀察。

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