李童希，李西野，黃美州，錢保林，陳 浩，付文廣

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院(四川省院士專家工作站)

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是由非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)進展為肝硬化、肝細胞癌之前的必要環(huán)節(jié)，標志著NAFLD進入不可逆階段。由于飲食和生活方式的差異，高碳水化合物飲食和高脂飲食更易導(dǎo)致肝脂肪的蓄積，西方國家中NAFLD的患病率明顯高于東方國家[1]，然而隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展所帶來的人群膳食結(jié)構(gòu)的巨大改變，最新統(tǒng)計顯示，2016年我國NAFLD患者約3 261萬例，呈明顯的上升趨勢[2]。NASH正嚴重威脅著人類健康，患病人口眾多，且隨著我國肥胖人口的增加將必然導(dǎo)致NASH的發(fā)病率不斷升高[3]，可能成為未來肝移植的最常見原因[4]。目前認為胰島素抵抗、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、各種細胞因子、遺傳多態(tài)性、脂肪毒性、腸道菌群等參與的“多重打擊”學(xué)說是NASH最公認的發(fā)病機制理論。研究表明，長時間及過強的ERS會引起脂代謝紊亂及炎癥，甚至可表現(xiàn)出纖維化的一系列病理損傷[5]，促進NASH的形成與發(fā)展。因此，本文將對目前前沿的ERS在NASH中的致病機制的研究作一概述。

1 ERS反應(yīng)及其信號傳導(dǎo)通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)作為一種有強大功能的核心細胞器，可參與大量蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成與加工，也是將折疊正確的蛋白質(zhì)運送到胞質(zhì)或分泌出胞的重要場所。細胞可根據(jù)其所處的生理和環(huán)境條件來調(diào)節(jié)ER的蛋白質(zhì)折疊能力，從而確保細胞膜結(jié)構(gòu)蛋白的高保真合成和蛋白質(zhì)分泌的功能。外源性物質(zhì)、氧化應(yīng)激、低氧以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔非折疊蛋白的累積等情況均可改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡，形成ERS，破壞ER的完整性[6]。而ER功能異常又將引起蛋白質(zhì)折疊的異常，繼而導(dǎo)致ER內(nèi)繼續(xù)出現(xiàn)未折疊或錯誤折疊的蛋白從而無法正常轉(zhuǎn)運和分泌，這些蛋白集聚在ER內(nèi)即可進一步加重ERS[7]。在這種情況下，ER內(nèi)會建立一個控制系統(tǒng)處理應(yīng)激態(tài)，即未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)會快速激活用于降低ER內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊負荷。UPR主要由蛋白酶R樣ER激酶(protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)三種跨膜蛋白介導(dǎo)。這些跨膜蛋白在生理狀態(tài)下并不參與UPR反應(yīng)，因其蛋白結(jié)合位點被B細胞免疫球蛋白結(jié)合蛋白/葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(B-cell immunoglobulin binding protein/glucose regulated protein 78，BIP/GRP78)結(jié)合而并不暴露[8]。但ERS時，BIP/GRP78與三種跨膜蛋白分離，從而形成三種通路調(diào)節(jié)折疊蛋白的質(zhì)量，感知錯誤折疊的蛋白積聚[9]，結(jié)合ER內(nèi)積聚的蛋白，達到減少ER內(nèi)蛋白質(zhì)蓄積的目的。

ERS時PERK通路激活，從而引起真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)發(fā)生磷酸化，進而可抑制蛋白質(zhì)的翻譯，減少蛋白質(zhì)的生成，達到降低ER內(nèi)蛋白質(zhì)折疊負荷、減少蛋白質(zhì)在ER內(nèi)堆積的目的。同時，磷酸化的eIF2α還可通過增加激活轉(zhuǎn)錄因子的途徑，選擇性地增加C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的翻譯[9]。CHOP是一種在ERS的情況下通過誘導(dǎo)參與凋亡的基因來觸發(fā)細胞死亡的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，且可能具有提前恢復(fù)因eIF2α磷酸化所抑制的mRNA翻譯的功能[10]，因此與NASH的形成密切相關(guān)。

IRE1通路在ERS時的激活依賴于X盒結(jié)合蛋白1(X-box-binding protein 1，XBP1)mRNA的自身剪切。剪切后的XBP1進入胞核內(nèi)，可通過促進GRP78的合成以及加強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解兩種方式減少未折疊蛋白的形成[11]，減少蛋白質(zhì)在ER蓄積。同時，IRE1也可以結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(tumour necrosis factor receptor associated factor 2，TRAF2)形成復(fù)合物，從而激活下游通路，產(chǎn)生氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，進而引起胰島素抵抗、炎癥和細胞凋亡，參與NASH的形成。

ERS時ATF6通路也被激活，活化的ATF6從ER膜釋放并轉(zhuǎn)運至高爾基體，在高爾基體中加工后將進入細胞核與ERS反應(yīng)元結(jié)合，激活GRP78、折疊酶、XBP1基因[12]，從而減少蛋白質(zhì)蓄積，降低折疊負荷。同時，ATF6也能與IRE1通路中剪切后的XBP1結(jié)合，參與IRE1通路促進蛋白質(zhì)折疊的過程[8，13]。

由此可見，ERS時建立的UPR其實是處理應(yīng)激態(tài)，降低蛋白質(zhì)折疊負荷的一種保護機制。但如果ERS過強或時間過長，UPR不足以緩解這種應(yīng)激態(tài)時，這種保護機制可能對機體帶來如脂代謝紊亂、炎癥、細胞凋亡等負面影響，這些病理改變將使NAFLD進展，進而引起NASH。

2 ERS在NASH發(fā)病機制中的作用

肝臟是人體重要器官，作為人體最大的代謝場所，肝細胞中ER豐富，可分泌大量的蛋白質(zhì)。因此，肝細胞中的ER功能至關(guān)重要，發(fā)生ERS將影響正常肝臟功能。而NASH是在NAFLD進展中出現(xiàn)嚴重的脂肪變性，另外還有肝細胞凋亡及點灶狀壞死，此期可見部分區(qū)域的炎癥和輕微纖維化(如門管區(qū)、竇周)，嚴重的NASH繼續(xù)進展可能演變?yōu)橹拘愿卫w維化，甚至更嚴重的肝病。研究表明小鼠肝臟中BIP/GRP78的特異性缺失可引起ERS，最終觀察到肝脂肪變性、肝細胞凋亡[14]；另外在NASH患者的肝臟和脂肪組織中均表現(xiàn)出ER穩(wěn)態(tài)失衡[15]。Li等[16]建立的NASH模型中，肝臟的炎癥因子及ERS相關(guān)的細胞凋亡蛋白表達增加，這些實驗結(jié)果均提示，NASH中的ERS與炎癥反應(yīng)、細胞凋亡的發(fā)生存在必然的聯(lián)系。因此，了解ERS在NASH分子機制中的效應(yīng)對于NASH的診治十分重要。

2.1 在NASH中引起脂肪代謝紊亂在NAFLD疾病的起始階段，單純性脂肪肝(simple fatty liver，SFL)形成，此期引起肝中脂質(zhì)堆積的原因眾多，包括極低密度脂蛋白分泌減少，游離脂肪酸氧化減少，乳糜微粒積累，脂肪組織分解減少或生成增加等途徑[8，17]。這種脂質(zhì)環(huán)境能加重ER內(nèi)蛋白折疊的負荷，引起ERS。ERS又能造成一系列病理改變讓SFL向NASH進展。研究表明，游離脂肪酸在引起ERS上發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]；高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的脂肪肝中發(fā)現(xiàn)了ERS[6]，也證實了這些異常堆積的脂質(zhì)可激活ERS從而調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。除了飲食脂質(zhì)和脂肪組織來源的脂肪酸的大量涌入外，脂肪從頭合成(De novo lipogenesis，DNL)的主要代謝產(chǎn)物飽和脂肪酸與ER應(yīng)激信號通路的上調(diào)有關(guān)，這反過來使脂質(zhì)代謝和膽固醇合成受到干擾，導(dǎo)致肝脂肪變性，成為NASH患者脂毒性和肝細胞ERS的主要驅(qū)動力[19]。

ERS發(fā)生時UPR信號通路將迅速激活，影響肝臟中的脂質(zhì)代謝。研究表明，PERK通路能通過抑制促脂肪生成的酶以及促進脂質(zhì)的磷酸化的方式調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[20]。高脂喂養(yǎng)的小鼠在肝組織中PERK和eIF2α表達明顯升高，而CHOP上游的激活轉(zhuǎn)錄因子基因敲除的小鼠在高脂飲食下可以避免飲食引起的肥胖、肝脂肪變性和高脂血癥[21-22]。這些實驗結(jié)果均表明PERK通路在肝細胞的脂肪代謝中起重要作用，并與NASH的肝脂肪變性形成有關(guān)。IRE1α-XBP1通路也被發(fā)現(xiàn)參與肝脂肪代謝，此通路主要調(diào)節(jié)甘油三酯的合成和VLDL的分泌。若特異性敲除肝中IRE1α的基因，會使肝中的VLDL分泌減少導(dǎo)致肝細胞中甘油三酯堆積[23-24]。另外，特異性敲除肝中XBP1基因的小鼠也被觀察到可以反饋激活上游，而使IRE1過度活化，表現(xiàn)出低脂血癥以及肝脂質(zhì)合成速率低。Ozcan等[25]已證實，ERS正是通過UPR的IRE1通路激活JNK，從而引起肝的胰島素抵抗。胰島素抵抗也是NASH發(fā)病的關(guān)鍵因素，一旦發(fā)生胰島素抵抗可使脂質(zhì)環(huán)境加重，將進一步引起炎癥和細胞凋亡加重。因此，IRE1通路在NASH疾病進展與脂代謝中起到關(guān)鍵作用。ATF6也參與脂代謝調(diào)節(jié)。研究表明，ATF6通路可以促進肝脂肪酸氧化并遏制肝脂肪變性[26]。ATF6通路能在組蛋白去乙?；?1(histone deacetylase-1，HDAC1)的協(xié)同下，與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2)形成復(fù)合物而對SREBP2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生抑制作用，進而對存在于肝細胞中的甘油三酯水平進行有效地調(diào)控[27]。有研究觀察到敲除ATF6基因的小鼠發(fā)生ERS時，脂肪酸β-氧化、VLDL形成會被抑制，最終發(fā)生肝脂肪變性[26]。由此可見，在ERS條件下，UPR的三條通路均參與肝中脂代謝的調(diào)節(jié)。敲除PERK、IRE1或ATF6的任何一種跨膜蛋白，均能夠?qū)е滦∈蟮母谓M織出現(xiàn)脂肪變性，這也表明在肝臟的脂肪變性過程中UPR具有重要作用。然而，先前的ERS研究集中在UPR上，但非UPR途徑逐漸引起了研究人員的關(guān)注。非UPR途徑包括GSK-3途徑、PI3K/Akt途徑等，它們通過脂毒性誘導(dǎo)的ER相關(guān)凋亡導(dǎo)致NASH的發(fā)展[28]。

2.2 在NASH中引起炎癥炎癥是NASH的基礎(chǔ)病理變化，肝細胞內(nèi)脂質(zhì)的持續(xù)沉積會刺激巨噬細胞產(chǎn)生包括TNF-α、JNK、NF-κB及白介素6(IL-6)在內(nèi)的過量炎癥因子，導(dǎo)致肝臟的代謝性炎癥[29]。在致炎的過程中ERS作用明顯，UPR時IRE1-TRAF2復(fù)合物形成，從而激活釋放重要的促炎癥因子NF-κB和JNK，引起炎癥的發(fā)生[30]。有研究觀察到在缺乏JNK的小鼠中，促炎癥因子的表達減少[31]。而NASH致炎的過程中NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄因子同JNK一樣發(fā)揮關(guān)鍵作用[32]。研究表明，在NASH中UPR的三條通路均可激活NF-κB導(dǎo)致炎癥因子表達的上調(diào)，使包括IL-6及TNF-α在內(nèi)的炎癥因子全身性的釋放增加，促進炎癥的發(fā)生[33]。另外，PERK通路主要通過間接釋放核因子-κB激酶抑制劑(inhibitor nuclear factor kappa-B kinase，IKK)抑制IκB的方式激活NF-κB，而ATF6主要通過磷酸化蛋白激酶的方式直接激活NF-κB[34-35]。以上結(jié)論也證實了ERS中的UPR可以通過三條通路引起炎癥，參與NASH發(fā)生發(fā)展。

2.3 在NASH中引起細胞凋亡NASH患者會表現(xiàn)出肝細胞凋亡增加。使用凋亡抑制劑治療NASH可以有效地預(yù)防肝硬化及肝癌[36]。證明細胞凋亡是NASH發(fā)展的一個重要誘因和標志。ERS引起肝細胞的凋亡主要與JNK途徑和CHOP途徑相關(guān)。JNK途徑不僅可導(dǎo)致炎癥因子增多，同時，該通路還將對一種凋亡調(diào)節(jié)激酶(apoptosis signal regulating kinase，ASK)實現(xiàn)活化。此時JNK途徑可通過調(diào)節(jié)B細胞淋巴瘤的家族蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡[37]。如釋放促凋亡蛋白，活化Bcl-2源拮抗殺傷蛋白(Bcl-2 homologous antagonist killer，Bak)以及Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)導(dǎo)致細胞凋亡。同時JNK也可以通過抑制抗凋亡蛋白(如Bcl-XL、Bcl-2)的方式啟動細胞的凋亡程序[38]。另外，Caspase-12也發(fā)現(xiàn)可以被IRE1α-TRAF2復(fù)合物募集，參與到細胞凋亡中。研究表明，Caspase-12基因敲除小鼠在ERS條件下及四氯化碳誘導(dǎo)兩種條件下均觀察到了能夠抵抗細胞凋亡的表現(xiàn)，也均得出了肝損傷較正常對照組小鼠顯著減少的結(jié)論[39]。證明Caspase-12參與了ERS中細胞凋亡的機制。PERK及ATF6通路則可激活CHOP，CHOP也是引起細胞凋亡的重要因素。同JNK類似，ERS中CHOP可激活NF-κB，進而促進TNF、IL-8的分泌增加，CHOP也可通過調(diào)控B細胞淋巴瘤家族蛋白來誘導(dǎo)細胞凋亡[40]。但近年有研究觀察到高脂飲食的CHOP基因敲除小鼠形成了比野生小鼠更大的肝損傷、炎癥和肝細胞凋亡。這可能與CHOP基因敲除小鼠活化的巨噬細胞死亡減少導(dǎo)致積累在肝中有關(guān)[41]。除去JNK途徑和CHOP途徑，PERK信號通路還可使谷胱甘肽水平降低，導(dǎo)致活性氧積累,使得凋亡細胞數(shù)增加[42]。因此，UPR的三條通路引起細胞凋亡的作用是明確的，但CHOP在NASH發(fā)生發(fā)展中的作用仍不明確，可能既有預(yù)防NASH進展又有誘導(dǎo)細胞凋亡促進NASH進展的作用，有待進一步闡明。

2.4 在NASH中引起肝纖維化肝纖維化主要是由于肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSCs)這種非肝實質(zhì)細胞激活，從而增加了肝臟細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的產(chǎn)出，進而導(dǎo)致以間質(zhì)膠原為主的物質(zhì)沉積，最終使纖維形成[43]。而ERS也參與到纖維形成的過程中。目前研究認為，ERS可通過介導(dǎo)細胞凋亡、調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)因子表達等途徑促進肝纖維化的形成[44]。在酒精/四氯化碳肝纖維化小鼠模型中，抑制IRE1通路可有效阻斷轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的釋放從而抑制HSCs的活化[45]。另外，在存在慢性肝損傷的情況下，PERK通路可通過增強TGF-β信號來維持HSCs的激活；也可通過下調(diào)核內(nèi)異質(zhì)核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A1，hnRNP A1)來促進肝纖維化的發(fā)生[46]，提示PERK通路也參與到促進肝纖維化的過程。近期文獻報道，ATF6相關(guān)基因缺失的小鼠心肌細胞中，觀察到成纖維細胞被過度激活，提示ATF6可能可抑制纖維化[47]。但ATF6通路對肝細胞纖維化的作用尚無文獻報道，仍有待進一步研究。

3 展望

NASH已成為威脅公共健康的常見疾病，作為重要慢性肝病之一。尚缺乏特異性的治療方式，且“多重打擊”學(xué)說尚未得到完全印證。但多種研究已證明ERS與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。ERS在NAFLD的脂質(zhì)環(huán)境下將發(fā)生炎癥、細胞凋亡、纖維化等病理改變而引起NASH，并可能向肝纖維化、肝細胞癌進展。綜上所述，干擾ERS的發(fā)生、提高ER處理錯誤折疊蛋白的能力以及在ERS發(fā)生時抑制NF-κB、CHOP、JNK以及Caspase等的表達均可能成為控制疾病進展的方式，對于未來NASH的治療具有重要的意義。