周鑫亞，燕書(shū)明，張萌萌，張婧怡，李 健

河南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科 河南大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003

消化系統(tǒng)腫瘤是全世界腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。目前，血清腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)、內(nèi)鏡檢查、組織病理學(xué)檢查等傳統(tǒng)方法，仍被廣泛應(yīng)用于包括消化系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的腫瘤篩查，甲胎蛋白(AFP)、血清癌胚抗原(CEA)、血清糖類抗原19-9(CA19-9)等腫瘤標(biāo)志物及影像學(xué)(超聲、CT等)，對(duì)于早期篩查和診斷的靈敏性和特異性相對(duì)較低[1-2]。組織活檢是臨床腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其不能反映腫瘤的異質(zhì)性，轉(zhuǎn)移性腫瘤可能存在原發(fā)腫瘤中未檢測(cè)到的突變[3]，即發(fā)生轉(zhuǎn)移前將惡性細(xì)胞和基因組物質(zhì)轉(zhuǎn)移到循環(huán)中。大多數(shù)消化道腫瘤患者首診時(shí)處于中-晚期，且有相對(duì)較低的5年生存率[3]。

液體活檢定義為對(duì)非固體生物組織的取樣和分析，例如血液和大多數(shù)其他體液(如尿液、唾液、腹胸水或腦脊液)。其代表一種快速和非侵入性的替代組織活檢的方法，并對(duì)縱向評(píng)估腫瘤(消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌等)的篩查、診斷和監(jiān)測(cè)方面具有優(yōu)勢(shì)[3-5]?；谘旱囊后w活檢包括分離和分析在血液中循環(huán)的腫瘤來(lái)源或與腫瘤相關(guān)的成分：循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、細(xì)胞外泌體及腫瘤衍生的循環(huán)核酸，如循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)腫瘤RNA(ctRNA)[1-3]。本文旨在總結(jié)有關(guān)液體活檢技術(shù)在食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和肝癌中臨床研究的最新進(jìn)展。

1 CTC

CTC從原發(fā)腫瘤實(shí)體或轉(zhuǎn)移病灶脫落后，通過(guò)血管和淋巴管釋放到患者的血液中，CTC被描述為原始腫瘤的種子，有可能生長(zhǎng)成新的轉(zhuǎn)移灶。大多數(shù)CTC會(huì)在數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡，只有小部分可達(dá)轉(zhuǎn)移部位，并在臨床癥狀出現(xiàn)前保持休眠狀態(tài)，然后在適當(dāng)條件下恢復(fù)，從而形成轉(zhuǎn)移導(dǎo)致腫瘤發(fā)病[6]。業(yè)已證明，CTC計(jì)數(shù)在包括消化系統(tǒng)腫瘤在內(nèi)的不同腫瘤中具有預(yù)后價(jià)值[6]。此外，CTC中基因突變和蛋白表達(dá)的信息是腫瘤篩查、治療反應(yīng)評(píng)估和生存預(yù)測(cè)的另一個(gè)重要標(biāo)志，如結(jié)直腸癌(CRC)有體細(xì)胞遺傳變異，包括單核苷酸變異(SNV)和較大體細(xì)胞結(jié)構(gòu)變異(SSVs)[1-2]。

1.1 食管癌Reeh等首次報(bào)道食管癌患者CTC檢測(cè)結(jié)果顯示[6]，CTC陽(yáng)性患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期(RFS)和總生存期(OS)顯著縮短。研究[6]表明，食管癌放療后CTC檢測(cè)的變化可預(yù)測(cè)RFS的預(yù)后價(jià)值，而與化療藥物無(wú)關(guān)；食管癌核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1(ERCC1)表達(dá)與更好的新輔助放療反應(yīng)相關(guān)。2020年針對(duì)CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)CTC對(duì)食管癌患者預(yù)后價(jià)值的薈萃分析顯示[7]，來(lái)自日本、德國(guó)和英國(guó)的7項(xiàng)2008年至2019年8組研究數(shù)據(jù)中包括405例食管癌患者，CTC陽(yáng)性患者比率中位數(shù)為19.7%(13.2%～50%)，食管癌患者CTC陽(yáng)性率與RFS和OS較短相關(guān)，且其對(duì)放化療效果較差。

1.2 胃癌CTC數(shù)量變化可能是胃癌的早期診斷生物標(biāo)志物。韓國(guó)一項(xiàng)包含116例胃癌患者和31名健康者的研究[8]顯示，97.1%患者具有CTC≥2/7.5 ml均為胃癌，其診斷的靈敏性和特異性分別為85.3%和90.3%。CTC數(shù)量和表型也可用于監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)。北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院的前瞻性研究顯示[9]，臨床病理特征相對(duì)較差胃癌患者術(shù)前和術(shù)后CTC較多。術(shù)后血液中CTC≥5/7.5 ml無(wú)病生存期(DFS)和OS明顯較短。治療后CTC數(shù)量增加也與早期復(fù)發(fā)有關(guān)。

一項(xiàng)胃癌患者CTC中程序性死亡受體配體1(PD-L1)表達(dá)研究顯示[6]，50例(71%)觀察到PD-L1+CTC。更高數(shù)量細(xì)胞表面波形蛋白(CSV)+PD-L1+CTC與生存時(shí)間短和治療反應(yīng)較差顯著相關(guān)。胃癌患者外周血CTC和骨髓中彌散腫瘤細(xì)胞表面細(xì)胞角蛋白(CK)或CD44表型異質(zhì)性研究顯示[6]，41%(93例)患者血液或骨髓中均有CK陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，10%患者發(fā)現(xiàn)表達(dá)CD44細(xì)胞。CK+CD44+細(xì)胞顯著常見(jiàn)患者更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且與生存期顯著縮短有關(guān)。

1.3 CRCCTC中遺傳物質(zhì)可作為CRC腫瘤診斷的生物標(biāo)志物。Chen等[10]從90例CRC患者CTC中提取RNA，鑒定出具有高度差異表達(dá)率的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2癌基因(ECT2)，AUC值為0.821；血清CEA濃度低于診斷閾值5 ng/ml的患者中該基因檢測(cè)率也很高，ECT2表達(dá)可彌補(bǔ)當(dāng)前CEA測(cè)試在診斷和監(jiān)測(cè)CRC患者方面的不足。CTC檢測(cè)在CRC中的預(yù)后價(jià)值有重要意義。Wu等[2]前瞻性研究評(píng)估CTC對(duì)CRC肝轉(zhuǎn)移(CRC-LM)患者生存時(shí)間的影響，結(jié)論顯示盡管完全切除，但術(shù)前存在兩個(gè)或多個(gè)CTC與CRC-LM進(jìn)展和低生存期相關(guān)。另一研究[6]發(fā)現(xiàn)，與無(wú)轉(zhuǎn)移患者相比，CRC-LM患者外周血中CD133+和CD133+CD54+CD44+細(xì)胞亞群表達(dá)更高，腹部CT/MRI，CEA與CD133+CD54+CD44+細(xì)胞亞群結(jié)合可提高CRC-LM檢測(cè)和鑒別率，其靈敏性和特異性分別為88.2%和92.4%。

Messaritakis等[11]在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC)患者中檢測(cè)到癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子5(CEACAM5) mRNA陽(yáng)性CTC細(xì)胞是PFS和OS縮短相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素。Kirsten鼠內(nèi)瘤基因(KRAS)和鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1(BRAFV600E)突變患者中CEACAM5 mRNA陽(yáng)性CTC的檢測(cè)與較短無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)相關(guān)。此外，與具有CEACAM5+/KRAS野生型腫瘤患者相比，具有CEACAM5+/KRAS突變患者OS明顯更短。還有研究[6]發(fā)現(xiàn)，總CTC數(shù)量和顯示間充質(zhì)表型(mCTC)的CTC數(shù)量均與CRC患者晚期階段和轉(zhuǎn)移發(fā)生顯著相關(guān)，高亮氨酸重復(fù)序列G-蛋白偶聯(lián)受體5(LGR5)表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移發(fā)生顯著相關(guān)。Konczalla等[6]在監(jiān)測(cè)CRC患者CTC的SSVs變化中發(fā)現(xiàn)，可提供2～15個(gè)月(平均10個(gè)月)的時(shí)間來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，且SSVs檢測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的靈敏性和特異性均為100%。

1.4 胰腺癌胰腺癌患者CTC表型及數(shù)量研究提示與監(jiān)測(cè)預(yù)后有關(guān)。Gemenetzis等[12]主持對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)CTC動(dòng)力學(xué)的前瞻性縱向研究(CLUSTER研究，NCT02974764)鑒定出兩種主要CTC亞型：上皮CTC(eCTC)和間充質(zhì)CTC(mCTC)。接受新輔助化療患者總CTC、eCTC和mCTC明顯低于未經(jīng)治療符合前期切除條件患者；切除原發(fā)性腫瘤后，所有細(xì)胞亞型CTC負(fù)荷顯著減少，但并未消失；所有CTC亞群術(shù)前數(shù)量是未化療和新輔助治療后患者術(shù)后12個(gè)月內(nèi)早期復(fù)發(fā)的唯一預(yù)測(cè)因素。

Amantini等[13]發(fā)現(xiàn)，一線化療前后，血液中高CTC數(shù)量是晚期PDAC患者OS和PFS不良的預(yù)后因素。發(fā)現(xiàn)CTC中有兩個(gè)簇基因特征：第1個(gè)簇基因具有VEGFA、NOTCH1、EPCAM、IHH高表達(dá)，是胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)患者化療前的特征；第2個(gè)簇基因具有CD44、ALCAM、POU5F1B干細(xì)胞和多能性基因的高表達(dá)，是姑息性化療后的表現(xiàn)，這些數(shù)據(jù)支持CTC特異性生物標(biāo)志物的鑒定對(duì)改善晚期PDAC患者的預(yù)后和治療的臨床價(jià)值。

1.5 肝細(xì)胞癌(HCC)研究[5]顯示，根據(jù)HCC患者CTC的大小和形態(tài)分離并計(jì)數(shù)CTC，表明HCC檢測(cè)到CTC的存在和數(shù)量與較短生存期有關(guān)，提示CTC可作為AFP水平未升高患者的補(bǔ)充測(cè)試。有關(guān)HCC中CTC亞群的研究[6]顯示，這些亞群基于細(xì)胞表面標(biāo)記、RNA表達(dá)或基因組畸變而聚集，使用表面標(biāo)志物檢測(cè)具有腫瘤干細(xì)胞樣或間充質(zhì)特征的CTC具有預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的臨床價(jià)值。例如，HCC患者中g(shù)lypican-3(GPC3)陽(yáng)性CTC的存在與臨床病理相關(guān)聯(lián)，這些患者微小門(mén)靜脈侵襲發(fā)生率較高，DFS和OS較低[5]。表達(dá)AFP的CTC也與HCC轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，而攜帶CNV(chr 8)的CTC預(yù)測(cè)生存率更差[6]。還有研究[2]發(fā)現(xiàn)，HCC復(fù)發(fā)組CTC、mCTC、混合CTC總數(shù)量均顯著高于HCC非復(fù)發(fā)組，mCTC陽(yáng)性與HCC早期復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，并且mCTC陽(yáng)性患者PFS顯著縮短，這表明監(jiān)測(cè)術(shù)后mCTC可能是HCC早期復(fù)發(fā)潛在的預(yù)測(cè)指標(biāo)，而根除這些細(xì)胞可能為預(yù)防HCC復(fù)發(fā)開(kāi)辟治療途徑。

除CTC生物學(xué)特性外，CTC的傳播似乎也受到治療影響。數(shù)據(jù)表明[5]，手術(shù)誘導(dǎo)的肝臟切除操作與CTC的釋放有關(guān)。前路手術(shù)和傳統(tǒng)手術(shù)的比較表明，后者與CTC的高釋放及較差結(jié)局有關(guān)。約10%的肝移植接受者經(jīng)歷移植后肝癌復(fù)發(fā)，并導(dǎo)致幾乎所有患者死亡，這與隱匿性轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)或CTC植入有關(guān)[5]。Toso等[14]描述關(guān)注HCC患者原位肝移植過(guò)程中的5個(gè)步驟，以盡量減少CTC擴(kuò)散進(jìn)而降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)：(1)選擇CTC基線水平較低者，在接受形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)組合中加入生物標(biāo)志物(如AFP或分子標(biāo)志物)；(2)減少圍手術(shù)期肝癌細(xì)胞的釋放，對(duì)腫瘤進(jìn)行細(xì)致的圍手術(shù)期處理；(3)通過(guò)減少移植肝缺血再灌注損傷來(lái)阻止CTC的植入，這已被證明能促進(jìn)癌細(xì)胞的植入和生長(zhǎng)；(4)使用抗癌藥物；(5)調(diào)節(jié)免疫以清除肝癌。

2 ctDNA

ctDNA通過(guò)主動(dòng)和被動(dòng)機(jī)制從實(shí)體瘤釋放到血液中，后者似乎占主導(dǎo)地位，部分是由細(xì)胞壞死和凋亡引起的，且發(fā)生在腫瘤任何階段，使ctDNA與其衍生腫瘤細(xì)胞具有相同的遺傳信息，包括點(diǎn)突變、甲基化變化、重排、單核苷酸變異和基因拷貝數(shù)變異(CNV)[15]。與CTC相比，ctDNA半衰期相對(duì)較長(zhǎng)，使其在反映腫瘤異質(zhì)性方面具有優(yōu)勢(shì)。數(shù)量變化等定量信息和遺傳缺陷等定性信息均是臨床上ctDNA的監(jiān)測(cè)目標(biāo)[15]。

2.1 食管癌研究[16]顯示，食管鱗癌患者血漿ctDNA水平顯著高于健康對(duì)照者，其在TNM晚期及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中顯著升高。食管癌不同類型存在甲基化ctDNA生物標(biāo)志物的差異。研究[16]顯示，術(shù)前高甲基化ctDNA(MSH2)的存在預(yù)示著209例所有階段食管鱗癌患者DFS較短，而在所有階段食管腺癌中，術(shù)前甲基化ctDNA(TAC1)與生存率無(wú)關(guān)。2009年一項(xiàng)研究24例食管鱗癌和35例0～Ⅲ期食管腺癌患者術(shù)前和術(shù)后評(píng)估DAPK和APC啟動(dòng)子甲基化[16]，術(shù)前存在DAPK甲基化與較差存活期相關(guān)，而術(shù)后檢測(cè)到APC啟動(dòng)子甲基化與殘留腫瘤相關(guān)；食管腺癌亞組結(jié)合術(shù)前APC和DAPK檢測(cè)可顯著提高區(qū)分短期(<2.5年)和長(zhǎng)期幸存者的靈敏性和特異性。研究顯示，食管鱗癌和食管腺癌在致癌機(jī)制與發(fā)展過(guò)程中差異顯著不同：CCND1、NOTCH1、SOX2和/或TP63的基因組異常擴(kuò)增在食管鱗癌較為常見(jiàn)，而食管腺癌中ERBB2、VEGF、AKRAS、GATA4和GATA6基因異常較為突出[15]。

2.2 胃癌ctDNA的數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化均與胃癌患者預(yù)后有關(guān)。Kim等[17]通過(guò)WGS分析監(jiān)測(cè)胃癌術(shù)后ctDNA對(duì)癌癥特異性重排的影響，發(fā)現(xiàn)25例胃癌中19例出現(xiàn)個(gè)性化癌癥特異性重排。術(shù)后ctDNA的存在與手術(shù)12個(gè)月內(nèi)胃癌復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。還有研究[15]顯示，晚期胃癌標(biāo)本中L1和SAT-α甲基化狀態(tài)與靜脈浸潤(rùn)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較短DFS及OS等臨床病理參數(shù)相關(guān)。對(duì)胃癌中ctDNA染色體不穩(wěn)定性與治療前后的治療反應(yīng)研究[2]顯示，93%對(duì)藥物治療敏感的患者有穩(wěn)定的染色體，而52%對(duì)治療耐藥的患者則無(wú)，這表明檢測(cè)ctDNA的染色體不穩(wěn)定性可能有助于監(jiān)測(cè)胃癌患者的治療反應(yīng)。

2.3 CRCCRC臨床病理因素與ctDNA之間的有關(guān)研究顯示，無(wú)論腫瘤分期、研究規(guī)模、腫瘤標(biāo)志物、檢測(cè)方法和樣本類型如何，CRC患者ctDNA陽(yáng)性與RFS和OS顯著關(guān)聯(lián)，CRC-LM患者ctDNA明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移患者，腹膜轉(zhuǎn)移與ctDNA無(wú)關(guān)，但ctDNA與轉(zhuǎn)移器官數(shù)量的關(guān)系存在爭(zhēng)議[3]。Tabernero等[18]進(jìn)行CORRECT Ⅲ期試驗(yàn)探討ctDNA作為預(yù)后參數(shù)和mCRC治療前突變檢測(cè)的作用，166例mCRC患者接受安慰劑治療，337例接受瑞戈非尼治療。盡管患者間差異很大，但在安慰劑組和瑞戈非尼組中，高ctDNA濃度與較短中位OS和PFS相關(guān)。還有研究[3]顯示，瑞戈非尼組血漿中存在KRAS突變患者PFS比無(wú)突變患者短，血漿中KRAS突變而非腫瘤組織中KRAS突變的預(yù)后價(jià)值已經(jīng)得到確認(rèn)。

在CRC手術(shù)或治療后，即使無(wú)任何其他疾病臨床證據(jù)，ctDNA檢測(cè)也可能表明存在微小殘留病(MRD)。Osumi等[3]前瞻性評(píng)估已切除Ⅱ期CRC患者ctDNA檢測(cè)MRD能力，178例未接受輔助化療患者中有14例(7.9%)術(shù)后檢測(cè)到ctDNA，且11例(78.6%)隨訪27個(gè)月時(shí)復(fù)發(fā)；92.1%術(shù)后ctDNA陰性，僅有16例(9.8%)患者術(shù)后復(fù)發(fā)，化療結(jié)束后ctDNA存在也與較短RFS相關(guān)。

研究[3]表明，組織中存在RAS野生型的CRC患者，以及血漿KRAS陽(yáng)性和BRAF突變可抵抗EGFR抑制劑。ctDNA時(shí)程分析表明，在EGFR阻斷期間，一些突變迅速出現(xiàn)，且通?？稍诜派湫詮?fù)發(fā)前檢測(cè)到，例如抗KRAS突變克隆可出現(xiàn)在放射線確認(rèn)疾病進(jìn)展前檢測(cè)長(zhǎng)達(dá)10個(gè)月；在接受EGFR抑制劑治療mCRC患者中檢測(cè)到多個(gè)KRAS突變。接受EGFR抑制劑治療患者的ctDNA時(shí)程分析表明，在EGFR阻斷期間出現(xiàn)的KRAS突變克隆在EGFR抑制劑停用后下降，允許對(duì)EGFR抑制劑進(jìn)行再激發(fā)治療，從而再次導(dǎo)致應(yīng)答[3]。

2.4 胰腺癌胰腺癌ctDNA甲基化可作為早期診斷的生物標(biāo)志物。研究[4]顯示，ADAMTS1和BNC1基因的甲基化可作為診斷和篩選胰腺癌的生物標(biāo)志物，兩基因組對(duì)Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌的靈敏性和特異性分別為94.8%和91.6%，與僅57.1%的CA19-9相比，兩基因組AUC為0.95[4]。還有研究[4]顯示，PDAC患者的半胱氨酸雙加氧酶1基因(CDO1)高甲基化顯著高于胰腺良性疾病患者，其區(qū)分PDAC和健康者的靈敏性為95%，比胰液細(xì)胞學(xué)(33%)或EUS-FNA細(xì)胞學(xué)(88%)更敏感。

此外，Berger等[19]研究PDAC中ctDNA最常見(jiàn)7個(gè)突變基因(TP53、SMAD4、CDKN2A、KRAS、APC、ATM和FBXW7)的檢測(cè)數(shù)量，選擇KRAS和TP53的組合突變等位基因頻率(CMAF)反映ctDNA的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)ctDNA中這些基因水平在治療時(shí)明顯降低，進(jìn)展時(shí)明顯升高；未經(jīng)治療患者中，治療期間CMAF水平與PFS顯著相關(guān)。

2.5 HCCCNV是肝癌發(fā)生的潛在驅(qū)動(dòng)因素，其主要影響chr8和chr11。有關(guān)HCC檢測(cè)ctDNA分析CNVs的研究提示[5]，HCC患者血漿中存在異常短和長(zhǎng)的DNA分子群體。較短的那些優(yōu)先攜帶與腫瘤相關(guān)的拷貝數(shù)發(fā)生畸變，該DNA片段約160 bp，且由凋亡癌細(xì)胞釋放。

研究[5]顯示，血漿CNV和SNV水平與HCC患者腫瘤負(fù)荷動(dòng)態(tài)相關(guān)，兩者在平均4.6個(gè)月成像前可檢測(cè)到腫瘤發(fā)生，且優(yōu)于AFP、AFP-L3%和脫-γ-羧基凝血酶原(DCP)的性能，ctDNA能夠檢測(cè)MRD并預(yù)測(cè)患者的RFS和OS，ctDNA與DCP結(jié)合可提高M(jìn)RD檢測(cè)的靈敏性。Oh等[20]針對(duì)HCC患者中cfDNA中的VEGFA擴(kuò)增進(jìn)行研究，假設(shè)它可預(yù)測(cè)對(duì)索拉非尼的反應(yīng)。該研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者使用索拉非尼未達(dá)到疾病控制患者cfDNA水平顯著高于達(dá)到疾病控制的患者。盡管高濃度的cfDNA與較低存活率有關(guān)，但VEGFA比率并不是索拉非尼治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子。

研究[5]發(fā)現(xiàn)，HCC患者血中檢測(cè)到腫瘤相關(guān)基因(TERT啟動(dòng)子、TP53和CTNNB1和MLH1)突變與血管浸潤(rùn)有關(guān)，這些突變與更短生存期或更高復(fù)發(fā)率相關(guān)。一些研究確定與HCC預(yù)后相關(guān)特定基因的甲基化變化：LINE-1低甲基化和IGFBP7甲基化與較低生存率相關(guān)，而CTCFL低甲基化可預(yù)測(cè)較高腫瘤復(fù)發(fā)率和較低生存率[5]。此外，一項(xiàng)包括1 095例HCC的研究產(chǎn)生8種診斷和預(yù)后標(biāo)志物的診斷預(yù)測(cè)模型(SH3PXD2A、C11orf9、PPFIA1、chr 17:78、SERPINB5、NOTCH3、GRHL2和TMEM8B)，除提供高診斷準(zhǔn)確率外，該預(yù)測(cè)模型還與生存率相關(guān)[5]，這些發(fā)現(xiàn)證明ctDNA甲基化標(biāo)志物在HCC的診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后中的實(shí)用性。

3 細(xì)胞外泌體

外泌體是磷脂雙層納米囊泡，直徑30～150 nm，由包括癌細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞類型分泌且存在于許多生物液體中[21]。外泌體可利用各種機(jī)制進(jìn)入受體細(xì)胞，如結(jié)合細(xì)胞表面受體、與質(zhì)膜融合以及通過(guò)內(nèi)吞作用內(nèi)化。其包含一系列分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和不同類型的核酸，并通過(guò)生物活性載體的轉(zhuǎn)移在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。外泌體數(shù)量及其核酸突變及蛋白質(zhì)表達(dá)變化可用于腫瘤診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)。

3.1 食管癌研究[21]發(fā)現(xiàn)，miR-93-5p可通過(guò)外泌體在食管癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，并可能通過(guò)PTEN/PI3K/Akt通路下調(diào)p21和Cyclin D1的表達(dá)，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖。還有研究顯示[21]，Stathmin-1可通過(guò)外泌體傳遞而促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制Stathmin-1表達(dá)可增強(qiáng)鱗癌細(xì)胞系對(duì)多西他賽和輻射的靈敏性，其對(duì)食管鱗癌的侵襲性預(yù)示著預(yù)后不良。Ke等[22]在與食管腺癌衍生的細(xì)胞外囊泡共培養(yǎng)的Gastroids(胃類器官)中發(fā)現(xiàn)，來(lái)自Gastroids的外泌體miR-25和miR-210也可促進(jìn)胃腺的增殖和細(xì)胞活力。

外泌體可能參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程。針對(duì)來(lái)自受照射T細(xì)胞的外泌體在體外表現(xiàn)出促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞系TE13細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)β-catenin和NF-κB/snail通路促進(jìn)EMT[21]。還有研究顯示，TE2-CD63-GFP荷瘤小鼠血漿中發(fā)現(xiàn)GFP陽(yáng)性小泡；同時(shí)收集SCC患者和非惡性患者血漿，顯示SCC患者比非惡性患者具有更多外泌體，低水平外泌體顯示預(yù)后不良[21]。

3.2 胃癌各種外泌體RNA和蛋白質(zhì)已被確定為胃癌新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。研究[2]顯示，兩個(gè)早期胃癌存在特異性外泌體lncRNA包括lncUEGC1和lncUEGC2，其在早期胃癌和胃癌細(xì)胞株的外泌體中顯著上調(diào)。在鑒別早期胃癌和癌前疾患慢性萎縮性胃炎中，lncUEGC1的AUC值分別為0.8760和0.8406，高于CEA的診斷準(zhǔn)確率。還有研究[2]發(fā)現(xiàn)，lncRNA-PCSK2-2∶1在胃癌患者血清外泌體中表達(dá)明顯下調(diào)，其AUC為0.896，診斷靈敏性為84%，特異性為86.5%。診斷時(shí)AUC為0.732的胃癌患者外體lncRNA GNAQ-6∶1的表達(dá)水平較低。此外，Kumata等[23]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外泌體miR-23b水平顯著低于健康對(duì)照組。外泌體miR-23b是胃癌每個(gè)階段中OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。利用胃液來(lái)源的外泌體DNA樣本進(jìn)行分析[2]，外泌體BARHL2基因甲基化水平有助于區(qū)分胃癌患者和非胃癌者，AUC為0.923。

3.3 CRC研究[24]顯示，外泌體非編碼RNA，如miRNAs、lncRNAs和circRNAs，已經(jīng)證明在早期檢測(cè)CRC的診斷潛力，其靈敏性和特異性高于CEA和CA19-9。與健康者相比，包括let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223、miR-23a和miR-301a等一些miRNAs在CRC被上調(diào)，且手術(shù)后明顯下調(diào)，所有miRNAs的靈敏性均高于CEA(30.7%)和CA19-9(16.0%)。在CRC-LM患者中[24]，外泌體miR21高度上調(diào)，其OS或DFS短于那些外體miR-21水平低者。此外，外泌體PODXL和ECM1在CRC患者中的表達(dá)增加與預(yù)后不良有關(guān)，如遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和較短復(fù)發(fā)時(shí)間[24]。Kobayashi等[25]研究顯示，CRC和高級(jí)別腺瘤患者的外泌體數(shù)量明顯高于低風(fēng)險(xiǎn)病變(增生性息肉和低級(jí)別腺瘤)患者或健康對(duì)照組。此外，外泌體數(shù)量與典型病變大小、數(shù)量及兩因素之和顯著相關(guān)。

外泌體具有TNM分期特異性的預(yù)后潛力，可作為CRC最常用化療方案(5-FU和FOLFOX)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物[24]。Yagi等[26]研究顯示，CRC患者外泌體miR-125b水平顯著較高，尤其是對(duì)mFOLFOX6化療耐藥患者。外泌體miR-125b水平可能有助于早期檢測(cè)對(duì)基于mFOLFOX6的一線化療的耐藥性。此外，化療前外泌體miR-125b是晚期/復(fù)發(fā)性CRC患者PFS的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。

3.4 胰腺癌外泌體中RNA的異常表達(dá)提示胰腺癌早期診斷的潛力。研究[4]顯示，含有外泌體8個(gè)長(zhǎng)RNA的診斷組合(FGA、KRT19、HIST1H2BK、ITIH2、MARCH2、CLDN1、MAL2和TIMP1)在診斷PDAC時(shí)，以0.949的AUC識(shí)別可切除的Ⅰ/Ⅱ期腫瘤，且在區(qū)分PDAC與慢性胰腺炎(CP)方面表現(xiàn)出優(yōu)于CA19-9的性能(AUC分別為0.931和0.873)。還有研究[4]顯示，在PDACⅡ期患者中發(fā)現(xiàn)外泌體miR-451a顯著上調(diào)，這些患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)且OS和DFS較短。

Nakamura等[27]通過(guò)ERCP收集27例PDAC和8例CP的胰液樣品研究顯示，外泌體Ex-miR-21和Ex-miR-155水平將PDAC與CP患者區(qū)分的AUC分別為0.90和0.89。外泌體Ex-miR-21、Ex-miR-155水平和胰液細(xì)胞學(xué)的準(zhǔn)確度分別為83%、89%和74%。當(dāng)Ex-miR水平與胰液細(xì)胞學(xué)相結(jié)合時(shí)，準(zhǔn)確度提高到91%。

3.5 HCC外泌體中RNA分子用于預(yù)測(cè)HCC的診斷與預(yù)后。研究顯示[5]，血漿中高水平外泌體mRNA-hnRNPH1可鑒別HCC和慢性乙型肝炎患者，AUC為0.865。還有研究[5]顯示，與慢性肝病相比，HCC中外泌體miR-10b-5p和miR-215-5p表達(dá)過(guò)高，血清外泌體miR-10b-5p診斷早期HCC的AUC為0.934；高水平外泌體miR-215-5p與DFS較差顯著相關(guān)。此外，兩種特異性外泌體lncRNA(ENSG00000258332.1和LINC00635)可區(qū)分HCC和慢性肝炎，其AUC分別為0.719和0.750，同時(shí)這兩種lncRNA與血清AFP的結(jié)合可改善AUC至0.894[5]。

Lee等[28]在HCC患者中發(fā)現(xiàn)循環(huán)外泌體miR-21和lncRNA-ATB均與TNM分期和其他預(yù)后因素有關(guān)，包括T分期和門(mén)靜脈血栓形成，該兩標(biāo)志物均與較短O(píng)S和PFS有關(guān)。研究[29]顯示，HCC患者血漿中16個(gè)非編碼RNA被證實(shí)顯著上調(diào)，包括RN7SL1、SNHG1、ZFAS1和LINC01359。外泌體RN7SL1及其S片段具有較高HCC診斷準(zhǔn)確率(AUC=0.87)。此外，RN7SL1S片段濃度較高是HCC生存率下降的獨(dú)立因素，僅RN7SL1S片段可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和克隆形成生長(zhǎng)。

4 ctRNA

ctRNA已被發(fā)現(xiàn)存在于血循環(huán)中，且一定程度上具有作為癌癥生物標(biāo)志物的潛力。與DNA相比，循環(huán)中RNA不穩(wěn)定，半衰期較短，因此，ctRNA主要檢測(cè)目標(biāo)是mRNA片段和miRNAs。此外，lncRNA、circRNA和tRNA衍生片段(TRF)在癌癥診斷和治療監(jiān)測(cè)中具有新的生物標(biāo)志物的潛力。外周血和其他體液中ctRNA的廣泛分類和分布使其成為液體活檢的優(yōu)越生物標(biāo)志物[2]。

4.1 食管癌研究[30]證明，非編碼RNAs，如miRNAs和lncRNAs介導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡或相互調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲。miRNA通過(guò)直接與mRNA結(jié)合來(lái)控制食管鱗癌的發(fā)展而抑制mRNA翻譯。研究[30]表明，miR-338-5p和miR-200c分別通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯來(lái)增強(qiáng)食管鱗癌的放射靈敏性。同樣，miR-29c、miR-125a-5p和miR-1分別增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶、順鉑和吉非替尼等抗癌藥物的靈敏性[33]。Chen等[31]研究發(fā)現(xiàn)，linc-VLDLR由外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，通過(guò)上調(diào)靶細(xì)胞中ATP結(jié)合盒G2(ABCG2)，導(dǎo)致食管鱗癌細(xì)胞中的阿霉素耐藥。這些結(jié)果表明，lncRNAs可增加或減少化學(xué)抗性或放射抗性，并且外泌體介導(dǎo)的lncRNAs可能在食管鱗癌中傳遞化學(xué)抗性。此外，LINC00473、lncRNA FAM201A和LINC00657通過(guò)調(diào)節(jié)miRNAs來(lái)削弱放療的效果。因此，對(duì)lncRNA研究為食管鱗癌的臨床治療提供了基礎(chǔ)。

4.2 胃癌胃液因其直接從細(xì)胞分泌而未被肝臟清除，可能成為胃癌的良好生物標(biāo)志物來(lái)源。據(jù)報(bào)道[32]，胃癌患者胃液樣品中的致癌miRNA(miR-421、miR-21和miR-106a)和抑癌miRNA(miR-129和miR-133a)的表達(dá)水平較無(wú)胃癌患者發(fā)生變化，這些胃液miRNA是檢測(cè)胃癌的潛在生物標(biāo)記。

還有研究[32]表明，胃癌患者血清miR-21水平升高，陽(yáng)性預(yù)測(cè)率為88%，而CA19-9和CEA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)率分別為50%和46%。循環(huán)血漿miR-196a顯示出比miR-196b或miR-196a/b組合更高的診斷能力，強(qiáng)調(diào)其作為潛在有用的胃癌生物標(biāo)志物的能力。同樣，發(fā)現(xiàn)6種血清miRNAs(miR-10b-5p、miR-132-3p、miR-1855p、miR-195-5p、miR-20a-3p和miR-296-5p)在胃癌患者中表達(dá)上調(diào)，6種miRNAs的AUC為0.702[32]。

ctRNA在胃癌中也具有預(yù)后價(jià)值。Shimura等[33]研究顯示，3種特異性miRNAs(miR-30a-5p、miR-659-3p和miR-3917)在腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌患者中過(guò)度表達(dá)，并加以區(qū)分是否腹膜轉(zhuǎn)移患者的AUC值為0.82，且這些miRNA高表達(dá)還與預(yù)后不良相關(guān)。

circRNA通過(guò)與miRNA的相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)。改變的circRNA與腫瘤發(fā)生有關(guān)，包括胃癌。改變的circRNA-miRNA-mRNA相互作用也與胃癌有關(guān)。已經(jīng)在胃癌組織中報(bào)道了各種上調(diào)或下調(diào)的circRNA。由于它們的豐度、穩(wěn)定性、組織特異性表達(dá)及在不同體液和外泌體中的廣泛循環(huán)，circRNA可能成為新的診斷生物標(biāo)志物和胃癌治療靶點(diǎn)[32]。例如，血漿hsa_circ_0000520水平顯示出比組織更好的診斷準(zhǔn)確性。血漿hsa_circ_0000520的AUC、靈敏性和特異性分別為0.897、82%和84%，高于組織水平(分別為0.613、54%和86%)[32]。盡管circRNA可被視為潛在的胃癌生物標(biāo)志物，但它們的有用性需要使用大型隊(duì)列進(jìn)一步驗(yàn)證。

4.3 CRC新的證據(jù)證實(shí)了ctRNA在CRC診斷和預(yù)后中的潛力。Yamada等[34]研究顯示，CRC患者血清miR-21、miR-29a和miR-125b的水平顯著升高，區(qū)分早期CRC患者血清miR-21、miR-29a、miR-125b和三者結(jié)合的AUC值分別為0.706、0.741、0.806和0.827。還有研究[35]顯示，早期CRC患者中miR-506和miR-4316的表達(dá)升高，miR-506和miR-4316可將CRC與健康對(duì)照者區(qū)分的特異性和靈敏性分別為76.8%和60.7%、76.8%和75.0%，可作為早期CRC診斷的潛在血漿標(biāo)志物。

此外，CRC-LM患者血清miR-203上調(diào)，血清miR-203水平較高CRC患者的整體生存率相對(duì)較短，血清高水平miR-203與不良生存和轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明其是CRC患者有潛力的非侵入性預(yù)后和轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[35]。此外，CRC患者血漿miR-199a-5p的增加與較長(zhǎng)RFS有關(guān)。低水平血清miR-497和miR-30a-5p在CRC患者中是早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的有前途的生物標(biāo)志物。血清tRF/miR-1280在CRC患者中表達(dá)較低，可抑制CRC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，這為進(jìn)一步證實(shí)tRF/miR-1280作為生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值提供證據(jù)[35]。

4.4 胰腺癌研究[36]表明，PDAC患者血清miR-133a水平降低和lncRNA ABHD11-AS1水平升高，用于PDAC早期診斷的AUC分別為0.893和0.947。同樣，血清miR-21和miR-34a在PDAC組和健康組之間存在差異表達(dá)，miR-21和miR-34a的AUC分別為0.889和0.865[36]。此外，低表達(dá)的miR-373和高表達(dá)的miR-629被認(rèn)為是PDAC患者早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的有前途的生物標(biāo)志物[36]。

研究表明，PDAC患者circ-LDLRAD3的上調(diào)有助于疾病的早期診斷，circ-LDLRAD3的高表達(dá)與靜脈浸潤(rùn)、淋巴浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。如果與CA19-9結(jié)合，AUC可達(dá)0.87[36]。高水平的血漿miR-221-3p與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。miR-221-3p遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的診斷功效優(yōu)于CA19-9(AUC：0.689vs0.587)[36]。高血清miR-196a水平PDAC患者生存率較差，miR-210低表達(dá)PDAC患者生存率較好。

4.5 HCC許多circ-miRNAs在HCC中顯示了預(yù)后價(jià)值。低水平的miR-1、miR-122、miR-26a、miR-29a和miR-223-3p與較低的生存率相關(guān)。miR-155、miR-96和miR-193-5p水平高的患者生存率較低[5]。一項(xiàng)研究報(bào)道116例HCC患者全基因組圖譜顯示[37]，慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化和HCC患者中5個(gè)上調(diào)miRNA(miR-122-5p、miR-125b-5p、miR-885-5p、miR-100-5p和miR-148a-3p)是CHB感染的潛在生物標(biāo)志物，而miR-34a-5p可能是肝硬化的生物標(biāo)志物。值得注意的是，4個(gè)miRNA(miR-1972、miR-193a-5p、miR-214-3p和miR-365a-3p)可將HCC與其他非HCC個(gè)體區(qū)分開(kāi)。

與miRNAs不同，循環(huán)中mRNAs非常不穩(wěn)定，很少作為液體活檢分析物進(jìn)行研究。目前有兩項(xiàng)研究檢測(cè)了循環(huán)中編碼AFP的mRNAs濃度[5]。第一組包括38例接受部分切除HCC患者，顯示AFP mRNA的檢測(cè)與肝外復(fù)發(fā)和更短的DFS相關(guān)。第二組在204例(59.5%)和48例(14.0%)HCC患者中檢測(cè)到AFP和hTERT mRNA。AFP mRNA表達(dá)與腫瘤數(shù)量相關(guān)，但hTERT表達(dá)與臨床特征之間無(wú)關(guān)，但未能確定生存率與AFP或hTERT mRNA表達(dá)之間的預(yù)后影響。

5 結(jié)論

液體活檢具有微創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，作為一種有價(jià)值的組織活檢替代方法逐漸引起研究者的重視。液體活檢作為一種基于個(gè)體特征的無(wú)創(chuàng)性腫瘤檢測(cè)策略，在個(gè)性化醫(yī)療中發(fā)揮著重要作用。利用ddPCR、NGS和蛋白質(zhì)組學(xué)等先進(jìn)技術(shù)分析液體活檢的生物標(biāo)志物。此外，各種新技術(shù)也在開(kāi)發(fā)中，以利用從血液樣本中獲得的信息的復(fù)雜性。然而，液體活檢在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用受到一些挑戰(zhàn)的阻礙，只有解決這些問(wèn)題，液體活檢在臨床中的作用才能牢固確立。首先，缺乏基礎(chǔ)與臨床研究標(biāo)準(zhǔn)化是其發(fā)展受限的主要原因，如樣品類型收集與儲(chǔ)存條件、候選分子篩選與和適宜的檢測(cè)技術(shù)等。隨著生物標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，基于芯片的自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備能夠在較短時(shí)間和高成本純化步驟的情況下對(duì)全血中標(biāo)志物進(jìn)行分析，這可能有助于解決這一問(wèn)題。其次，循環(huán)中腫瘤生物標(biāo)志物的含量較低，且受到其他細(xì)胞的干擾，對(duì)檢測(cè)策略的靈敏性和特異性提出了更高要求，而現(xiàn)有的檢測(cè)方法大多存在不足。此外，檢測(cè)生物標(biāo)志物的特殊設(shè)備阻礙了液體活檢從實(shí)驗(yàn)室到臨床的廣泛應(yīng)用。如何簡(jiǎn)化測(cè)試過(guò)程，降低測(cè)試成本是今后需要考慮的問(wèn)題。近年來(lái)的研究表明，液體活檢在消化道腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后預(yù)測(cè)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其臨床應(yīng)用潛力巨大。