楊 慧，吳巍蕓

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 湛江 524001

在上世紀70年代就有研究發(fā)現(xiàn)，在真核細胞的Poly(A)RNA的片段中存在6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)甲基化修飾，認為這可能是其中一些轉(zhuǎn)錄本翻譯成蛋白質(zhì)的方式，但受當時研究方法的限制，未能進一步明確這種修飾的作用[1]。隨著表觀遺傳學(xué)機制的深入研究及表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域的興起，脂肪與肥胖相關(guān)基因(fat mass and obesity associated，F(xiàn)TO)被證實在哺乳動物體內(nèi)可介導(dǎo)m6A發(fā)生去甲基化修飾，過表達FTO可降低mRNA中的m6A水平，從而影響基因表達，揭示了轉(zhuǎn)錄后mRNA水平的修飾也能夠參與基因表達調(diào)控[2]。m6A修飾普遍存在于哺乳動物、病原微生物和植物中，在人體生長發(fā)育過程及多種疾病中也扮演著重要角色[3-4]。異常的m6A甲基化修飾也參與了消化系統(tǒng)多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。本文圍繞m6A修飾在消化系統(tǒng)疾病中的研究進展作一概述。

1 m6A甲基化修飾概述

目前真核生物中已經(jīng)鑒定的RNA修飾已超過150種，主要發(fā)生在mRNA、tRNA、rRNA及其他非編碼RNA上，是轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控方式[5]。m6A甲基化修飾，指的是在mRNA腺嘌呤堿基的第6位N引入甲基或去除甲基，從而影響靶基因的表達。這種修飾是mRNA中聚腺苷酸化最常見的內(nèi)部修飾，修飾頻率在成熟mRNA中豐度更高[6]。高通量測序發(fā)現(xiàn)，m6A有序分布在蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequence，CDS)、終止密碼子附近和3′非翻譯區(qū)(3′untranslatated region，3′UTR)，主要發(fā)生在mRNA的高度保守序列RRACH motif(R=G/A；H=U/A/C)內(nèi)[6]。m6A甲基化修飾幾乎參與mRNA代謝的每個階段，包括mRNA前體剪接以及mRNA的出核轉(zhuǎn)運、穩(wěn)定性、翻譯效率、降解、miRNA成熟等[7]，從而影響相關(guān)基因表達，廣泛參與胚胎發(fā)育、生物鐘調(diào)控、細胞自噬、免疫反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等病理生理過程[4，8-11]。

2 m6A甲基化修飾相關(guān)酶及其功能

m6A甲基化修飾的生物學(xué)過程由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白介導(dǎo)，甲基轉(zhuǎn)移酶主要由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase like 3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase like 14，METTL14)以及腎母細胞瘤1-結(jié)合蛋白(Wilms′ tumor 1-associating protein，WTAP)組成復(fù)合體，作用是催化mRNA腺嘌呤第6位N加入甲基；去甲基化酶包括FTO和α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶alkB同源物5(α-ketoglutarate dependent dioxygenase alkB homolog 5，ALKBH5)，作用是催化m6A去除甲基；m6A閱讀蛋白主要包括YTH結(jié)構(gòu)域蛋白1/2/3(YTH domain family protein 1/2/3，YTHDF1/2/3)、YTH結(jié)構(gòu)域包含蛋白1/2(YTH domain containing protein 1/2，YTHDC1/2)，可識別發(fā)生m6A甲基化的mRNA并與之特異結(jié)合，影響mRNA剪接、翻譯、降解等[7]。

2.1 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶m6A甲基轉(zhuǎn)移酶也稱編碼器(writers)。甲基轉(zhuǎn)移酶以復(fù)合物形式催化mRNA上腺嘌呤發(fā)生m6A甲基化修飾。METTL3是S-腺苷-L-蛋氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶家族中的成員，是m6A甲基化修飾的主要催化活性酶，在富含mRNA剪接因子的核斑點上和細胞質(zhì)中可見其存在[12]。METTL3單獨存在時無催化活性，需與METTL14結(jié)合形成復(fù)合物發(fā)揮作用。METTL14無催化結(jié)構(gòu)域，不具有酶促活性，但可作為RNA結(jié)合支架，與METTL3通過氫鍵形成穩(wěn)定的異二聚體復(fù)合物并促進METTL3的催化活性，在體內(nèi)和體外均可催化mRNA發(fā)生m6A甲基化修飾[13]。WTAP是pre-mRNA剪接調(diào)節(jié)因子，缺乏甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，在體外不影響METTL3/METTL14復(fù)合物的活性，在體內(nèi)作為甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞基，招募METTL3和METTL14定位到核斑點提高mRNA的m6A修飾水平[14-15]。還有研究新發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白16(methyltransferase like 16，METTL16)[16]、CCCH型鋅指蛋白13(Zinc finger CCCH-type containing 13，ZC3H13)[17]、RNA結(jié)合基序蛋白15/15B(RNA binding motif protein 15/15B，RBM15/15B)[18]也作為甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的組分促進m6A甲基化修飾。

2.2 m6A去甲基化酶m6A去甲基化酶被稱為消碼器(erasers)，作用是催化已被甲基化修飾的m6A去除甲基。FTO和ALKBH5是兩個主要的去甲基化酶，均為二價鐵/a-銅戊二酸依賴型雙加氧酶AlkB家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO在哺乳動物細胞核和細胞質(zhì)中均可介導(dǎo)m6A發(fā)生去甲基化修飾[19]。m6A在FTO催化下經(jīng)歷hm6A、f6A兩個中間產(chǎn)物生成腺嘌呤[13]。ALKBH5可通過對目的基因的m6A修飾位點去甲基化，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[20]。甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的發(fā)現(xiàn)證實了m6A修飾具有動態(tài)可逆性，兩者共同維持細胞m6A甲基化和去甲基化的動態(tài)平衡。

2.3 m6A閱讀蛋白m6A閱讀蛋白被稱為讀碼器(readers)。YTHDF1/2/3主要存在于細胞質(zhì)，YTHDF1和YHTDF3相互結(jié)合可促進m6A修飾的mRNA的翻譯效率，并介導(dǎo)YTHDF2所致的mRNA降解[21]。YTHDF2能直接與CCR4-NOT脫腺苷酶復(fù)合物支架亞基CNOT1的SH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促進m6A修飾的mRNA脫腺苷化和降解[22]。YTHDC1定位于細胞核內(nèi)，與前體mRNA剪接因子SRSF3結(jié)合到mRNA的m6A位點，調(diào)控mRNA選擇性剪接，然后RNA出核因子NXF1結(jié)合到SRSF3上，促進m6A修飾的mRNA出核[23]。YTHDC2存在于細胞質(zhì)，能夠促進m6A修飾的mRNA的翻譯，也可加速m6A修飾的mRNA降解[24]。新近還有研究報道，真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIF3)[25]、不均一型核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1，HNRNPA2B1)[26]、胰島素樣生長因子2信使核糖核酸結(jié)合蛋白1/2/3(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1/2/3，IGF2BP1/2/3)[17]等也可作為m6A閱讀蛋白參與前體miRNA加工、選擇性剪接、mRNA翻譯和穩(wěn)定性等。

3 m6A修飾與消化系統(tǒng)疾病

異常m6A修飾參與人體多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。消化系統(tǒng)疾病如腫瘤、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎等也與異常m6A修飾密切相關(guān)。

3.1 m6A修飾與消化系統(tǒng)腫瘤

3.1.1 m6A修飾與胃癌：在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA LINC00470表達上調(diào)，高表達LINC00470的患者遠處轉(zhuǎn)移多見，TNM分期較晚，總生存期縮短，預(yù)后更差；細胞實驗表明過表達LINC00470通過促進METTL3甲基化修飾抑癌基因PTEN mRNA，提高其m6A水平，YTHDF2特異性識別并降解m6A修飾的PTEN mRNA，降低PTEN表達，從而促進胃癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。Zhang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5在胃癌細胞中高表達，ALKBH5通過降低lncRNA NEAT1 m6A甲基化水平，使得NEAT1表達上調(diào)，從而促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

3.1.2 m6A修飾與肝癌：研究發(fā)現(xiàn)，METTL3在肝癌組織中表達升高，提示預(yù)后不良，穩(wěn)定過表達METTL3的肝癌細胞形成的裸鼠皮下瘤體，體積和重量較對照組明顯增加，細胞實驗發(fā)現(xiàn)，過表達METTL3可促進肝癌細胞的增殖和遷移，并提高細胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子2(SOCS2)mRNA的m6A水平，YTHDF2識別并降解m6A修飾的SOCS2 mRNA，降低SOCS2表達，進而促進肝癌的惡性進展[29]。Chen等發(fā)現(xiàn)，WTAP在肝癌中過表達，WTAP可提高抑癌基因ETS1 mRNA的m6A修飾水平，導(dǎo)致ETS1表達降低，腫瘤抑制因子p21和p27的轉(zhuǎn)錄受阻，促進了癌細胞增殖，總體生存期預(yù)后不佳[30]。在肝細胞癌組織中還發(fā)現(xiàn)FTO和丙酮酸激酶(PKM2)表達水平上調(diào)，敲低FTO導(dǎo)致PKM2 mRNA m6A水平升高，降低PKM2表達，抑制肝癌的增殖，而過表達PKM2可以逆轉(zhuǎn)FTO沉默導(dǎo)致的肝癌抑制，表明FTO可通過降低PKM2 mRNA m6A水平，提高PKM2表達，從而促進肝癌的進展[31]。Hou等[32]證實，在肝癌細胞中缺氧誘導(dǎo)因子2α(HIF-2α)抑制了YTHDF2表達，YTHDF2沉默導(dǎo)致白細胞介素11(IL-11)mRNA和serpin家族E成員2(SERPINE2)mRNA m6A水平升高，促進IL-11和SERPINE2表達，介導(dǎo)癌細胞增殖和腫瘤血管生成，從而促進肝癌的惡性進程。

3.1.3 m6A修飾與胰腺癌：He等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中ALKBH5表達降低，RNA總體m6A修飾水平增高；過表達ALKBH5可導(dǎo)致長鏈非編碼RNA KCNK15-AS1 m6A水平降低，KCNK15-AS1的表達上調(diào)，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而減弱胰腺癌細胞的遷移能力和侵襲能力，提示ALKBH5可作為胰腺癌的治療靶點。

3.1.4 m6A修飾與結(jié)直腸癌：Li等[34]發(fā)現(xiàn)，METTL3、IGF2BP2在結(jié)直腸癌組織中表達上調(diào)，并與預(yù)后不良相關(guān)，過表達METTL3后，轉(zhuǎn)錄因子SOX2 mRNA m6A水平升高，IGF2BP2可識別并結(jié)合SOX2 mRNA的m6A修飾位點，抑制其降解，促進SOX2表達，從而導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。還有研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF3在結(jié)直腸癌組織中高表達，與更晚的TNM分期、更差的總生存率、更短的中位生存時間相關(guān)，而lncRNA GAS5低表達，發(fā)揮抑癌作用，兩者呈負相關(guān)；表達轉(zhuǎn)錄共激活因子相關(guān)蛋白YAP可上調(diào)YTHDF3表達水平，使得m6A修飾的lncRNA GAS5降解增多，GAS5表達下調(diào)，從而促進結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲[35]。

3.2 m6A修飾與消化系統(tǒng)非腫瘤性疾病

3.2.1 m6A修飾與非酒精性脂肪性肝?。悍蔷凭灾拘愿尾≈傅氖浅饩凭推渌鞔_的肝損傷因素的一組臨床綜合征，以甘油三酯過度蓄積和肝細胞脂肪變性為主要病理特征，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，但其確切發(fā)病機制仍不清楚。Zuo等[36]研究發(fā)現(xiàn)，METTL3在肝癌中表達升高，使長鏈非編碼RNA LINC00958 m6A修飾水平上調(diào)，促進LINC00958表達，從而使得人肝癌衍生生長因子表達增加，進一步導(dǎo)致脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶SREBP1、FASN、SCD1和ACC1表達上調(diào)，促進肝臟脂肪累積和肝癌進展。還有研究報道，在小鼠脂肪肝中YTHDC2表達降低，m6A甲基化修飾水平升高；過表達YTHDC2通過識別并結(jié)合固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(Sterol regulatory element-binding protein 1c，Srebp-1c)mRNA 3′UTR的m6A位點，促使Srebp-1c mRNA降解，抑制Srebp-1c表達，從而改善肥胖小鼠的肝脂肪變性和胰島素抵抗[37]。

3.2.2 m6A修飾與病毒性肝炎：Gokhale等研究發(fā)現(xiàn)，在丙型肝炎病毒感染的肝細胞中，敲低METTL3/METTL14或YTHDF1/2/3可導(dǎo)致HCV RNA表達上調(diào)，HCV顆粒增多，敲低FTO則導(dǎo)致HCV RNA表達降低，HCV顆粒減少；進一步研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2能夠特異性結(jié)合HCV RNA包膜糖蛋白E1的m6A位點，抑制HCV RNA與核心蛋白結(jié)合，減少HCV顆粒生成，表明m6A甲基化修飾能夠負向調(diào)控HCV的生命周期[38]。還有研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染激活先天免疫反應(yīng)信號通路，促使METTL3/METTL14提高絲/蘇氨酸蛋白激酶RIOK3 mRNA的m6A修飾水平，增強YTHDF1與m6A修飾的RIOK3 mRNA結(jié)合并促進其翻譯，導(dǎo)致RIOK3表達升高，抑制HCV顆粒生成；HCV感染激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)信號通路降低RNA結(jié)合蛋白CRIBP mRNA m6A水平，導(dǎo)致YTHDF1與CRIBP mRNA結(jié)合減弱并促進其選擇性剪接，其長異構(gòu)體CIRBP-L表達降低，抑制HCV顆粒生成，研究認為HCV感染誘導(dǎo)的mRNA m6A甲基化修飾可能影響宿主反應(yīng)和病毒復(fù)制[39]。

在HBV轉(zhuǎn)染的肝細胞和慢性乙肝患者肝組織中均存在m6A修飾，細胞實驗發(fā)現(xiàn)m6A修飾發(fā)生在HBV前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)的5′端、3′端ε莖環(huán)和HBV RNA 3′端的ε莖環(huán)上，敲低METTL3/14可導(dǎo)致pgRNA 的m6A水平降低，pgRNA半衰期延長，乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)和乙肝病毒S蛋白(hepatitis B virus S protein，HBs)表達升高，HBV DNA表達降低，敲低YTHDF2/YTHDF3也導(dǎo)致pgRNA水平和HBc和HBs表達升高，敲低FTO/ALKBH5則導(dǎo)致HBc和HBs表達降低，HBV DNA表達增加；結(jié)果表明，m6A修飾能夠影響HBV的生命周期，降低HBV RNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性以及HBV蛋白的表達[40]。

4 展望

越來越多的研究證實了異常m6A修飾在疾病中的重要作用，新的發(fā)病機制和靶點給臨床治療提供了新方向，有利于藥物研發(fā)，預(yù)防和減少疾病的發(fā)病率、并發(fā)癥和死亡率。m6A修飾的研究還處在發(fā)展階段，m6A修飾相關(guān)的一些機制和信號通路尚未完全清楚。m6A甲基化修飾也與消化系統(tǒng)疾病有關(guān)，可能是甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶通過調(diào)節(jié)不同靶基因的m6A水平，共同導(dǎo)致疾病發(fā)展，或存在某種機制導(dǎo)致它們競爭性結(jié)合同一個基因，這些問題仍有待進一步研究。隨著m6A修飾研究的深入，有望發(fā)現(xiàn)和闡明消化系統(tǒng)疾病更多的發(fā)病機制，為疾病的診斷和治療開拓更廣闊的思路。