劉健慧，耿鳳珍，張先舟，高 浩，李 聰，高 潔，檀建新,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000）

沙門氏菌（Salmonella）是常見(jiàn)的食源性致病菌，可通過(guò)污染食品進(jìn)入腸道，經(jīng)大量繁殖后引起嘔吐、腹痛、腹瀉。全世界每年由沙門氏菌導(dǎo)致的患病人數(shù)高達(dá)9 380萬(wàn)，死亡15.5萬(wàn) 人[1-4]。其中，因食用被其污染的畜產(chǎn)品致病的人數(shù)占沙門氏菌病例的75%，是爆發(fā)公共健康問(wèn)題的主要原因[5-7]。近年來(lái)，抗生素的濫用、細(xì)菌自身耐藥性的提升等都對(duì)食品安全問(wèn)題構(gòu)成了威脅[8-9]。

食源性病原菌因少量存在于食品中而易被背景微生物區(qū)系所掩蓋，難以識(shí)別[10]。從食品中高效準(zhǔn)確識(shí)別和鑒定出病原菌是防范食品安全事件發(fā)生的前提。目前沙門氏菌的檢測(cè)方法有多種，各有優(yōu)缺點(diǎn)。如：常規(guī)檢測(cè)法包括預(yù)富集、選擇性富集、選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)和生化測(cè)試等步驟，雖特異性高，但耗時(shí)長(zhǎng)，且對(duì)操作人員要求較高[11]。免疫學(xué)檢測(cè)法雖操作相對(duì)簡(jiǎn)單、靈敏，但抗體的制備繁瑣、價(jià)格昂貴且不易得到[12]。隨著核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的完善[13]，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[14]、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)[15]、跨越式滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)[16]等均已用于致病菌的檢測(cè)，這些方法方便快捷、特異靈敏、不需復(fù)雜設(shè)備，但因其引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、成本高，特別是由于氣溶膠污染容易出現(xiàn)假陽(yáng)性等弊端，在一定程度上限制了其應(yīng)用。核酸適配體[17]檢測(cè)法，具有特異、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，但適配體結(jié)構(gòu)受環(huán)境因素影響大，與目標(biāo)物不易結(jié)合成牢固的復(fù)合體，技術(shù)上仍有待完善。本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定性和實(shí)用性強(qiáng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[18]，同時(shí)引入G-四聯(lián)體可視化檢測(cè)概念，可達(dá)到較其他檢測(cè)方法相近的直觀、定量的檢測(cè)效果[19]。

G-四聯(lián)體是富含鳥嘌呤（G）的DNA或RNA序列串聯(lián)重復(fù)形成的非規(guī)范的四聯(lián)結(jié)構(gòu)，在真核端粒中過(guò)度表達(dá)，起到增殖或生長(zhǎng)抑制作用[20-22]。Gellert等[23]通過(guò)X射線證明由4 個(gè)鳥嘌呤形成的共平面四分體，可通過(guò)氫鍵和堿基堆積作用形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體，其結(jié)構(gòu)有平行、反平行和混合式3 種形式[24]。穩(wěn)定的G-四聯(lián)體可與氯高鐵血紅素（Hemin）結(jié)合，形成具有過(guò)氧化物酶活性的模擬酶（DNAzyme），催化H2O2與2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基-苯并噻唑琳-6-磺酸)二胺鹽（2,2’-diazo-bis(3-ethylbenzothiazolyn-6-sulfonic acid) diamine salt，ABTS）由無(wú)色變?yōu)榫G色[25]，基于這一原理，已實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子[26-27]、核酸分子[28]等的信號(hào)放大檢測(cè)。由于這些檢測(cè)體系中最終信號(hào)的強(qiáng)弱與G-四聯(lián)體的量呈正比，因此，將G-四聯(lián)體序列（或其互補(bǔ)序列）偶聯(lián)到用于特異性識(shí)別目標(biāo)核酸序列上，通過(guò)高效擴(kuò)增目標(biāo)序列，可實(shí)現(xiàn)G-四聯(lián)體的大量富集而將檢測(cè)信號(hào)放大，并用于目標(biāo)序列的檢測(cè)。本研究將PCR的特異性、靈敏性與G-四聯(lián)體的DNAzyme酶學(xué)活性、生物傳感器特性相結(jié)合，以沙門氏菌invH基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)5’端偶聯(lián)G-四聯(lián)體反向互補(bǔ)序列的PCR擴(kuò)增引物，通過(guò)對(duì)靶基因特異性擴(kuò)增得到大量帶有G-四聯(lián)體的PCR產(chǎn)物，并形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，發(fā)揮DNAzyme活性，建立了針對(duì)沙門氏菌的G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用的可視化檢測(cè)方法，以期為食源性致病菌的靈敏、快速、直觀檢測(cè)提供一種新策略和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用菌株如表1所示，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供；引物由金唯智生物科技有限公司合成；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒天根生化科技有限公司；2×Es TaqMaster Mix（Dye）北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；100 bp DNA ladder寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、瓊脂糖 北京全式金生物技術(shù)有限公司；Hemin、過(guò)氧化氫、二甲基亞砜 北京Solarbio公司；ABTS 美國(guó)Sigma公司；其他主要試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 本研究所用菌種Table 1 Strains used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

MTH-012型旋渦混合儀 海門其林貝爾儀器制造有限公司；070-851型PCR儀 德國(guó)Biometra公司；DYY-10 C型電泳儀 北京市六一儀器廠；JY04S-3E型凝膠成像分析系統(tǒng) 北京科普爾科技發(fā)展有限公司；K5500型超微量核酸測(cè)量?jī)x 北京凱奧科技發(fā)展有限公司；iMark酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌基因組提取

取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液，提取細(xì)菌基因組DNA，具體操作方法見(jiàn)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書。用核酸測(cè)量?jī)x對(duì)其DNA濃度及純度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出用于特異性識(shí)別和擴(kuò)增invH序列的上下游引物，上游引物（H-F）序列為：5’-GAAAGAGCAACTGGCCAACG-3’，下游引物（H-R）序列為：5’-ATGCTTGAGCTGATTGC GC-3’，并在引物的5’端外加一段G-四聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列，修飾后的上游引物（G-F）序列為：5’-CCCACC CACCCACCC GAAAGAGCAACTGGCCAACG-3’，修飾后的下游引物（G-R）序列為：5’-CCCACCCA CCCACCC ATGCTTGAGCTGATTGCGC-3’，其中5’-CCCACCCACCCACCC-3’為G-四聯(lián)體序列(G3T)3G3的反向互補(bǔ)，其在K+離子存在條件下形成平行G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，并且隨著富G序列的不斷延長(zhǎng)，其穩(wěn)定性無(wú)明顯變化，可視化反應(yīng)較明顯[29]。

1.3.3 PCR反應(yīng)體系與條件優(yōu)化

以沙門氏菌基因組DNA為模板，用H-F/R作引物PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，膠回收，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸蛋白儀測(cè)定濃度后作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模板。

以G-F/R為引物，進(jìn)行G-四聯(lián)體與PCR擴(kuò)增聯(lián)用可視化檢測(cè)體系的優(yōu)化。首先，在無(wú)模板PCR體系中，觀測(cè)1、2、3、4、5、6、8、10 μmol/L引物濃度下引物二聚體形成及對(duì)G-四聯(lián)體顯色反應(yīng)的影響；之后進(jìn)行引物濃度與模板質(zhì)量濃度之間的優(yōu)化；確定最適引物濃度后再進(jìn)行不同循環(huán)數(shù)與模板質(zhì)量濃度的PCR。引物濃度梯度設(shè)置為2、3、4、6 μmol/L；循環(huán)數(shù)梯度設(shè)置為20、23、25、28、30 個(gè)循環(huán)。

各優(yōu)化組經(jīng)過(guò)可視化判斷，最終確定PCR反應(yīng)體系為：50 μL 2×Es TaqMaster Mix（Dye），4 μL上、下游修飾引物G-F/R（4 μmol/L），4 μL DNA模板，用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)至100 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，72 ℃延伸5 min，30 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳（140 V、40 min）鑒定，利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果觀察分析。

1.3.4 G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用的可視化反應(yīng)體系優(yōu)化

按照DNA純化回收試劑盒步驟回收的PCR產(chǎn)物中加入30 μL K+緩沖液（40 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、0.05% Triton-X）與15 μL不同終濃度Hemin工作液充分混勻，終濃度梯度設(shè)置為2、4、6、8、10 μmol/L。在PCR儀中95 ℃加熱使PCR產(chǎn)物變性，變性時(shí)間梯度設(shè)置為1、3、5、8、10 min。之后以2 ℃/s的速率從95 ℃降溫至4 ℃，并于4 ℃孵育，完成G-四聯(lián)體折疊，孵育時(shí)間梯度設(shè)置為5、10、20、30、40 min。最終加入50 μL的ABTS（1.28 mmol/L）和H2O2（1.28 mmol/L）進(jìn)行顯色反應(yīng)。室溫顯色5 min后，酶標(biāo)儀測(cè)量421 nm處的吸光度，選擇最優(yōu)的可視化結(jié)果進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化的特異性檢測(cè)

為驗(yàn)證構(gòu)建方法的特異性，分別對(duì)表1中16 株菌的基因組DNA進(jìn)行提取，其中包括7 株沙門氏菌和9 株非特異性菌株。根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出的最佳反應(yīng)條件和最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行G-四聯(lián)體與PCR擴(kuò)增方法聯(lián)用檢測(cè)，測(cè)定421 nm的吸光度，驗(yàn)證構(gòu)建的可視化檢測(cè)方法檢測(cè)沙門氏菌的特異性。

1.3.6 G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化的靈敏度檢測(cè)

過(guò)夜培養(yǎng)的甲型副傷寒沙門氏菌，取1 mL進(jìn)行基因組DNA的提取，之后將所提取的核酸進(jìn)行梯度稀釋并測(cè)其核酸含量，按照已經(jīng)優(yōu)化好的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再利用純化產(chǎn)物進(jìn)行G-四聯(lián)體顯色反應(yīng)，421 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定，以檢測(cè)該方法的靈敏度。

1.3.7 G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)法對(duì)人工污染牛奶樣品中沙門氏菌的檢出限

取過(guò)夜培養(yǎng)的沙門氏菌，0.85%的生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度各取1 mL進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。用上述各稀釋度菌液5 mL接種于45 mL滅菌的牛奶中，均質(zhì)后各取1 mL提取基因組DNA，作為檢測(cè)的模板，對(duì)G-四聯(lián)體與PCR擴(kuò)增聯(lián)用的人工污染牛奶進(jìn)行檢出限分析。

1.3.8 G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)法的實(shí)際應(yīng)用與評(píng)價(jià)

為檢驗(yàn)G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用方法在實(shí)際樣品中的檢測(cè)效果，在當(dāng)?shù)馗鞔蟪屑笆袌?chǎng)隨機(jī)購(gòu)買30 份容易被沙門氏菌污染的樣品，包括散裝牛奶10 種、鮮雞蛋10 種、鮮肉10 種。根據(jù)上述反應(yīng)程序，以30 份實(shí)際樣品提取的DNA進(jìn)行G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)按GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》方法檢測(cè)，其結(jié)果作為對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理計(jì)算及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制均采用Microsoft Excel 2010軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1 無(wú)目標(biāo)模板時(shí)引物濃度對(duì)G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用的可視化顯色效果影響

與常規(guī)PCR引物相比，本研究在引物的5’端額外加了G-四聯(lián)體的反向互補(bǔ)序列，使得引物長(zhǎng)度增加且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可能更易于二聚體的形成，引起非特異性擴(kuò)增，甚至影響G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而造成背景信號(hào)增大，干擾檢測(cè)結(jié)果。為排除這種可能性，把引物稀釋成10、8、6、5、4、3、2、1 μmol/L系列濃度，對(duì)其進(jìn)行G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用的可視化顯色觀察和檢測(cè)。由圖1A可知，不同引物濃度下，無(wú)模板PCR體系經(jīng)擴(kuò)增后未產(chǎn)生目的條帶，而引物二聚體的增加與引物濃度呈正比；由圖1B可知，不同引物濃度下，引物二聚體的存在對(duì)于顯色的影響用肉眼難以區(qū)分，421 nm波長(zhǎng)處吸光度較空白略有增加，但不同引物濃度間差異不明顯。因此，當(dāng)PCR體系中無(wú)目標(biāo)模板DNA時(shí)，引物濃度高低對(duì)G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用的可視化顯色效果無(wú)明顯影響。

圖1 無(wú)靶標(biāo)模板PCR體系中引物濃度對(duì)G-四聯(lián)體顯色反應(yīng)的影響Fig.1 Effects of different primer concentrations in PCR system without target templates on the chromogenic reaction of G-quadruplex

2.1.2 PCR體系中引物濃度對(duì)模板質(zhì)量濃度的優(yōu)化

由PCR擴(kuò)增原理知，當(dāng)模板質(zhì)量濃度固定時(shí)，在一定范圍內(nèi)隨著引物濃度的增加，PCR產(chǎn)物也會(huì)增多，反之亦然。因此，在DNA擴(kuò)增過(guò)程中，引物濃度與模板量之間存在著相互作用關(guān)系，找到兩者之間相對(duì)合適的濃度對(duì)于確定PCR檢測(cè)到的模板最低量至關(guān)重要。圖2顯示，當(dāng)引物濃度達(dá)到4 μmol/L時(shí)，模板檢出限為500 fg/μL，且不再隨著引物濃度的增加而改變，因此選用引物濃度4 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖2 引物濃度對(duì)模板質(zhì)量濃度優(yōu)化電泳圖Fig.2 Optimization of ratio of primer concentration to template concentration

2.1.3 PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

循環(huán)數(shù)優(yōu)化也是G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)方法構(gòu)建中的重要環(huán)節(jié)，循環(huán)數(shù)的多少直接影響PCR產(chǎn)物及G-四聯(lián)體的生成量。循環(huán)數(shù)少會(huì)影響靈敏度，循環(huán)數(shù)過(guò)多，又會(huì)導(dǎo)致不同模板質(zhì)量濃度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間差異不明顯，所以找到一個(gè)適合的循環(huán)數(shù)非常重要。在引物濃度設(shè)定為4 μmol/L的基礎(chǔ)上，可通過(guò)循環(huán)數(shù)與模板質(zhì)量濃度之間的合適條件確定循環(huán)數(shù)。

陰性對(duì)照以無(wú)菌ddH2O替代模板，圖3顯示，隨著模板質(zhì)量濃度的降低，A421nm比色結(jié)果與陰性對(duì)照之間的差異越來(lái)越小。不同的循環(huán)數(shù)比較，28、30 個(gè)循環(huán)對(duì)模板的檢出效率遠(yuǎn)高于20、23、25 個(gè)循環(huán)，檢出限更低，且30 個(gè)循環(huán)可視化效果最為明顯，故選擇30 個(gè)循環(huán)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 G-四聯(lián)體與PCR擴(kuò)增聯(lián)用可視化檢測(cè)顯色條件的優(yōu)化

2.2.1 Hemin終濃度的優(yōu)化

Hemin濃度會(huì)直接影響與G-四聯(lián)體結(jié)合后的復(fù)合體催化活性的強(qiáng)弱。將Hemin在檢測(cè)體系內(nèi)的終濃度設(shè)置為2、4、6、8、10 μmol/L進(jìn)行孵育，以此探究檢測(cè)體系中的最適Hemin的濃度。由圖4A可以看出，隨著Hemin濃度逐漸增大，體系吸光度逐漸增大，當(dāng)濃度到達(dá)6 μmol/L以后，檢測(cè)體系的吸光度幾乎達(dá)到飽和，趨于平穩(wěn)，故選擇Hemin的終濃度為6 μmol/L。

2.2.2 95 ℃變性時(shí)間的優(yōu)化

帶有G-四聯(lián)體互補(bǔ)序列的上下游引物經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，含有G-四聯(lián)體序列的雙鏈不斷積累，在互補(bǔ)堿基之間的氫鍵、堿基堆積力等分子作用力下會(huì)形成穩(wěn)定的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，影響G-四聯(lián)體形成。高溫可以引起雙鏈DNA變性成單鏈，而富G序列在單鏈時(shí)才會(huì)組裝形成特有的結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到G-四聯(lián)體的顯色效果。因此，使雙鏈DNA充分變性，是G-四聯(lián)體形成的前提。由圖4B可知，當(dāng)變性時(shí)間為1 min時(shí)，就能夠出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的顏色變化，說(shuō)明雙鏈DNA遭到破壞同時(shí)形成了G-四聯(lián)體；隨著95 ℃變性時(shí)間的延長(zhǎng)，顯色體系吸光度逐漸增大，且在8 min時(shí)達(dá)到了峰值，之后呈現(xiàn)較為平穩(wěn)的狀態(tài)，吸光度不再有較大的波動(dòng)，說(shuō)明當(dāng)溫度達(dá)到95 ℃且變性8 min后，該體系中的雙鏈達(dá)到全部解鏈的狀態(tài)，因此選用8 min的變性時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 4 ℃孵育時(shí)間的優(yōu)化

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的雙鏈最大程度的變性為單鏈，可保證G-四聯(lián)體的形成量達(dá)到最多，那么從95 ℃到4 ℃的急速降溫可使高溫下變性成的單鏈DNA盡量維持其單鏈狀態(tài)，又為G-四聯(lián)體保持穩(wěn)定打下基礎(chǔ)。由圖4C可知，當(dāng)4 ℃孵育時(shí)間達(dá)到5 min時(shí)就已經(jīng)有了肉眼可辨的顏色變化，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)，吸光度達(dá)到了最大，而后續(xù)隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，反而吸光度趨于下降。表明在10 min時(shí)，DNA復(fù)性成雙鏈的速率還較低，且單鏈DNA與Hemin發(fā)生結(jié)合的幾率大，吸光度高。而隨著4 ℃溫育時(shí)間的延長(zhǎng)，單鏈自身恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)的速率加快，與Hemin的復(fù)合效率變低，使得吸光度出現(xiàn)下降趨勢(shì)。所以選用4 ℃孵育時(shí)間10 min進(jìn)行后續(xù)的顯色實(shí)驗(yàn)。

圖4 Hemin濃度（A）、95 ℃變性時(shí)間（B）和4 ℃孵育時(shí)間（C）的優(yōu)化Fig.4 Optimization of hemin concentration (A), denaturation (95 ℃)time (B) and incubation (4 ℃) time (C)

2.3 G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)沙門氏菌的特異性

為評(píng)價(jià)該方法的特異性，分別對(duì)表1中16 株菌的基因組DNA進(jìn)行提取，根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出的最佳反應(yīng)條件和最優(yōu)反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增和G-四聯(lián)體顯色，在保證其他菌株的DNA濃度遠(yuǎn)大于沙門氏菌DNA濃度且其他條件相同下，驗(yàn)證構(gòu)建的可視化檢測(cè)方法對(duì)沙門氏菌的特異性。由圖5可知，只有含目標(biāo)菌基因組DNA（沙門氏菌基因組DNA）的反應(yīng)體系發(fā)生了明顯的顏色變化，其他含非目標(biāo)菌基因組DNA的反應(yīng)體系均未變色，證明G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)法對(duì)沙門氏菌具有高度的特異性。

圖5 G-四聯(lián)體與PCR擴(kuò)增聯(lián)用可視化檢測(cè)方法的特異性Fig.5 Specificity of the visual detection method

2.4 G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)靈敏度的確定

取1 mL培養(yǎng)過(guò)夜的沙門氏菌進(jìn)行基因組DNA的提取，之后將所提取的核酸進(jìn)行梯度稀釋并測(cè)其核酸含量，得到0.07、0.7、9.7、79.9、771.6 ng/μL的模板樣品，在優(yōu)化的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下進(jìn)行G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)，以確定用沙門氏菌基因組作模板時(shí)該方法的檢出限。由圖6A可知，空白對(duì)照顏色無(wú)明顯變化，且吸光度隨著沙門氏菌基因組DNA濃度的增加，顏色也越來(lái)越深。由圖6B可見(jiàn)，模板質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)（lgC）與吸光度之間存在良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.129 9x+0.217 9，R2=0.994 5，靈敏度達(dá)到0.07 ng/μL，說(shuō)明構(gòu)建的G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)方法的靈敏度效果好，足以對(duì)沙門氏菌屬進(jìn)行有效鑒別和定量檢測(cè)。

圖6 G-四聯(lián)體與PCR擴(kuò)增聯(lián)用可視化檢測(cè)方法的靈敏度Fig.6 Sensitivity of the visual detection method

2.5 G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)法對(duì)人工污染牛奶樣品中沙門氏菌的檢出限分析

利用G-四聯(lián)體與PCR擴(kuò)增聯(lián)用可視化檢測(cè)方法對(duì)沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株污染的牛奶進(jìn)行檢測(cè)，其中人工污染的牛奶中菌濃度為1.2×105～1.2×101CFU/mL，由圖7可知，當(dāng)污染牛奶中的菌濃度為1.2×105～1.2×102CFU/mL時(shí)，顯色較為明顯，檢出限為1.2×102CFU/mL，因此所建立的G-四聯(lián)體與PCR擴(kuò)增聯(lián)用可視化檢測(cè)方法便捷有效，可應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中。但此次檢測(cè)靈敏度相比于純菌的檢出限高，可能是由牛奶中蛋白含量高降低了基因組DNA的提取效率所致。

圖7 G-四聯(lián)體與PCR擴(kuò)增聯(lián)用可視化檢測(cè)人工污染沙門氏菌的牛奶樣品Fig.7 Application of the visual detection method to artificially contaminated samples

2.6 G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化的實(shí)際應(yīng)用與評(píng)價(jià)

對(duì)市場(chǎng)采集的30 份樣品分別采用可視化檢測(cè)與國(guó)標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果如表2所示，國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法檢測(cè)沙門氏菌陽(yáng)性2 例，采用G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)得到相同的檢測(cè)效果，檢測(cè)準(zhǔn)確率高達(dá)100%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)市售樣品的準(zhǔn)確檢測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用潛力。

表2 實(shí)際樣品檢測(cè)效果的評(píng)價(jià)Table 2 Evaluation of the visual detection method for actual samples in comparison with the national standard method

3 討論與結(jié)論

目前，關(guān)于PCR與G-四聯(lián)體反應(yīng)相結(jié)合的方法，已有對(duì)單核增生李斯特菌[30]、幽門螺桿菌[31]、乙肝病毒[32]的檢測(cè)報(bào)道。但其研究或達(dá)不到定量效果；或只在引物的一端加入G-四聯(lián)體的互補(bǔ)序列，導(dǎo)致反應(yīng)循環(huán)數(shù)多且目標(biāo)產(chǎn)物低；或是設(shè)計(jì)了復(fù)雜的催化信標(biāo)探針，增加了操作難度。本實(shí)驗(yàn)將PCR擴(kuò)增與G-四聯(lián)體聯(lián)用建立的可視化的沙門氏菌檢測(cè)方法，具有如下特點(diǎn)，一是利用PCR的特異性識(shí)別和高效擴(kuò)增目標(biāo)DNA的特點(diǎn)，既可以通過(guò)引物與沙門氏菌特異性基因片段識(shí)別保證檢測(cè)方法的特異性，又可以通過(guò)DNA的高效擴(kuò)增積累大量的與擴(kuò)增產(chǎn)物相連的G-四聯(lián)體序列，增強(qiáng)靈敏度。二是利用G-四聯(lián)體/Hemin的DNAzyme高效催化活性，催化H2O2將無(wú)色的ABTS2-氧化為綠色的ABTS*-。通過(guò)上述過(guò)程，可將兩次放大的信號(hào)轉(zhuǎn)變成肉眼可見(jiàn)的顏色變化，通過(guò)酶標(biāo)儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的高效、靈敏的定量檢測(cè)，同時(shí)也可以通過(guò)裸眼觀察顏色變化做出半定量或定性分析，避免了PCR凝膠電泳過(guò)程及EB污染等問(wèn)題。

G-四聯(lián)體作為一種模擬酶，與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶相比，具有較高化學(xué)穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單便于合成、易于修飾改良性狀等特點(diǎn)，如何巧妙地利用G-四聯(lián)體的過(guò)氧化物酶活性和生物傳感器特性，是當(dāng)前人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一[33]。要實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增和G-四聯(lián)體聯(lián)用可視化檢測(cè)沙門氏菌，關(guān)鍵在于如何獲得大量G-四聯(lián)體展現(xiàn)其酶學(xué)特性，進(jìn)而提高靈敏度。本研究主要采取如下措施：1）在設(shè)計(jì)引物時(shí)選擇了隨著富G序列的不斷的延長(zhǎng)，其穩(wěn)定性無(wú)變化，可視化反應(yīng)明顯的平行G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，提高反應(yīng)的靈敏度[29]；2）引物濃度與PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)是決定最終生成帶有G-四聯(lián)體序列的擴(kuò)增產(chǎn)物量的關(guān)鍵因素，引物濃度低或擴(kuò)增循環(huán)數(shù)少，生成的PCR產(chǎn)物及附帶的G-四聯(lián)體的量少、顯色淺，影響靈敏度。循環(huán)數(shù)過(guò)高，雖然靈敏度提高了，但是過(guò)高的擴(kuò)增結(jié)果將影響顯色的梯度，掩蓋了模板濃度（菌體濃度）的差異。因此，根據(jù)本研究結(jié)果選擇4 μmol/L及以上濃度，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在30左右，即可獲得較高的靈敏度和較好的顯色梯度效果。3）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在引物上同時(shí)標(biāo)記G-四聯(lián)體的互補(bǔ)序列，無(wú)目標(biāo)模板條件下擴(kuò)增后不會(huì)造成本底信號(hào)的明顯增加，也不影響有目標(biāo)模板時(shí)PCR正常擴(kuò)增，同時(shí)能在較少的循環(huán)數(shù)下，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的大量積累（如相同循環(huán)數(shù)下獲得的G-四聯(lián)體的量理論上至少是不對(duì)稱PCR法的2 倍）[34]，得到較好的可視梯度變化。4）與通過(guò)不對(duì)稱PCR及核酸外切酶酶切等方式獲取單鏈DNA相比[35-36]，本實(shí)驗(yàn)直接將PCR產(chǎn)物熱變性，且在變性前加入Hemin工作液，使DNA雙鏈解旋成富G單鏈DNA過(guò)程與Hemin結(jié)合形成G-四聯(lián)體同時(shí)進(jìn)行，減少了操作步驟和成本，縮短了檢測(cè)時(shí)間。

總之，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和一系列優(yōu)化策略，建立了G-四聯(lián)體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)沙門氏菌的方法，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、易于觀察、成本低，適合實(shí)地定性檢測(cè)或借助酶標(biāo)儀實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，為食源性致病菌在核酸檢測(cè)方面提供了新策略和思路。但實(shí)樣檢測(cè)與純菌樣品檢測(cè)相比，由于DNA提取效率降低，將影響靈敏度；另外，針對(duì)不同實(shí)際樣品，可能需要摸索和建立目標(biāo)病原菌的菌數(shù)對(duì)數(shù)、提取的基因組濃度與吸光度之間的函數(shù)關(guān)系曲線，才能實(shí)現(xiàn)有效準(zhǔn)確地檢測(cè)。