陳金男，葉 金,*，郭旭光，李 麗，劉洪美，吳 宇，王松雪,*

（1.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，糧油質(zhì)量安全研究所，北京 102629；2.河南省口岸食品檢驗(yàn)檢測所，河南 鄭州 450003）

玉米赤霉烯酮為首次從患有赤霉病的玉米中分離得到的鐮刀菌代謝產(chǎn)物，廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥等糧食及其制品中，嚴(yán)重危害人類及動(dòng)物的健康。玉米赤霉烯酮有強(qiáng)烈的生殖毒性和致畸作用，影響家畜的繁殖，給畜牧業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。我國和歐盟對谷物中的玉米赤霉烯酮制定了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中食品（谷物及其制品）中的玉米赤霉烯酮限量為60 μg/kg[5]。李丹迪等[7]對山東省濟(jì)南市區(qū)4 個(gè)不同地點(diǎn)隨機(jī)采集的50 份即食谷物加工制品中玉米赤霉烯酮含量進(jìn)行檢測，76.0%的樣本檢出玉米赤霉烯酮陽性，其中8 份樣品超過我國食品中規(guī)定限量，受污染樣品的最大值為國家限量標(biāo)準(zhǔn)值的3.1 倍。陳皆全[8]在2017—2019年間對廣西省百色市12 個(gè)縣（市、區(qū)）隨機(jī)抽取的186 份處于收獲期的玉米中玉米赤霉烯酮含量進(jìn)行檢測，玉米赤霉烯酮檢出率為45.16%，其中最高含量為4 221.0 μg/kg，超標(biāo)率為22.04%，收獲期玉米受污染較為嚴(yán)重。Golge等[9]從土耳其采集了240 份糧食樣本，其中，4%的小麥、20%的玉米、55%的稻谷和4%的面粉中檢測出玉米赤霉烯酮陽性，1 份稻谷樣本超過歐盟對玉米赤霉烯酮的限量。因此，糧食及其制品中的玉米赤霉烯酮污染較為普遍，加強(qiáng)對糧食中玉米赤霉烯酮污染情況的監(jiān)測至關(guān)重要。

樣品前處理是糧食中玉米赤霉烯酮分析方法的重要步驟。前處理方法影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度，是最耗時(shí)、容易出錯(cuò)的步驟。糧食中玉米赤霉烯酮的前處理方法主要有免疫親和柱法[10-11]、固相萃取柱法[12-13]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）[14-15]法等，上述方法雖然能夠有效提取糧食中的玉米赤霉烯酮，但是存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長、成本高等缺點(diǎn)。免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMBs）是新型磁性納米粒子材料，具有超順磁性、尺寸小及可進(jìn)行多樣化修飾等特點(diǎn)。近幾年，基于免疫磁珠的凈化方法由于靈敏度高、操作簡單、耗時(shí)短、可批處理樣品、人員要求低等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛關(guān)注與研究[16-17]。免疫磁珠凈化方法通過免疫磁珠上玉米赤霉烯酮抗體特異性的親和作用將玉米赤霉烯酮從樣品稀釋液中識別和富集出來，清洗雜質(zhì)，再利用有機(jī)試劑破壞免疫磁珠上抗體的空間結(jié)構(gòu)，從免疫磁珠上釋放玉米赤霉烯酮，便于后續(xù)的分析檢測。孫毅蒙等[18]以金屬有機(jī)框架為基礎(chǔ)，制備出Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA單抗磁珠用于玉米中玉米赤霉烯酮的檢測。制備磁珠的玉米赤霉烯酮毒素負(fù)載量為3 μg/100 mg。對玉米粉進(jìn)行3 個(gè)水平的添加回收率實(shí)驗(yàn)，回收率在84.61%～90.00%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.86%～9.44%。劉玉梅等[19]通過玉米赤霉烯酮與對苯二胺反應(yīng)，制備玉米赤霉烯酮免疫磁珠分離富集試劑盒，試劑盒對樣品中玉米赤霉烯酮的捕獲量為50 ng/mL。在捕獲量范圍內(nèi)的添加回收率為65.4%～93.8%，且對與玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)或功能相似的競爭藥物無交叉反應(yīng)，具有較高的特異性。上述免疫磁珠凈化方法雖然能夠滿足糧食中玉米赤霉烯酮的分離與純化，但是步驟仍較為復(fù)雜，需手動(dòng)進(jìn)行，且凈化時(shí)間較長。因此，采用自動(dòng)化、高通量的前處理方法具有重要意義[20-22]。本方法開發(fā)的自動(dòng)凈化、高通量前處理方法能有效減少前處理時(shí)間，提高效率，且避免人為因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可提高糧食中玉米赤霉烯酮常規(guī)檢測的準(zhǔn)確性、便捷性和重復(fù)性。

目前常規(guī)高效液相色譜法多用于檢測糧食中玉米赤霉烯酮，但該方法分析速度慢、溶劑耗費(fèi)多、靈敏度低。為建立一種高效、靈敏的快速定量分析方法，本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）檢測糧食中的玉米赤霉烯酮。相比于高效液相色譜，UPLC具有進(jìn)樣量小、分離度高、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，是近年來用于微量快速分析的熱門方法[23-26]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合免疫磁珠高通量自動(dòng)凈化的前處理方法，基于UPLC分離技術(shù)，建立一種操作簡單、快速準(zhǔn)確、成本低的檢測方法，以期滿足糧食中玉米赤霉烯酮高通量、自動(dòng)化、高準(zhǔn)確性和高靈敏度的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米赤霉烯酮甲醇溶液（GBW(E)100301）、玉米全粉嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW(E)100383）、國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)全麥粉玉米赤霉烯酮成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW(E)100384）、玉米全粉玉米赤霉烯酮成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW(E)100385）、糙米粉玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣品（TOXIN-JTZK-015）、全麥粉玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣品（TOXIN-JTZK-003）、全麥粉玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣品（TOXIN-JTZK-030）、全麥粉空白（TOXIN-JTZK-006）、玉米全粉空白（TOXINJTZK-005） 國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院；糧食中玉米赤霉烯酮免疫磁珠試劑盒 北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司；玉米赤霉烯酮免疫親和柱 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher公司；桶裝水 中國屈臣氏（香港）有限公司；0.2 μm PTFE膜針頭過濾器 美國PALL公司；高純氮北京千禧京城氣體有限公司；移液槍（100～1 000 μL）德國Eppendorf公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC儀、Acquity熒光檢測器 美國Waters公司；JJHZ10真菌毒素全自動(dòng)凈化儀 北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；MTV-100多管旋渦混合儀 杭州奧盛儀器有限公司；電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；N-EVAP112快速溶劑吹干器 美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用移液槍準(zhǔn)確吸取一定體積的玉米赤霉烯酮甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇-水（1∶1，V/V）稀釋成5、10、20、50、100、200、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液于2 mL進(jìn)樣瓶中，渦旋混勻后，室溫保存以備檢測。

1.3.2 樣品前處理

糧食樣品經(jīng)過粉碎（90%通過20 目篩）混勻后，準(zhǔn)確稱?。?.00±0.01）g于50 mL離心管中，加入15 mL提取液，充分振蕩20 min，室溫、7 000 r/min離心5 min。吸取1 mL上清液加入到試劑盒樣品孔中，將試劑盒放置到真菌毒素全自動(dòng)凈化儀中，啟動(dòng)玉米赤霉烯酮凈化程序。凈化結(jié)束后，及時(shí)吸取洗脫孔0.4 mL洗脫液，50 ℃氮吹至干，用0.4 mL流動(dòng)相進(jìn)行復(fù)溶，渦旋30 s溶解殘留物，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后收集在進(jìn)樣瓶中，室溫保存以備檢測。

1.3.3 免疫磁珠高通量自動(dòng)凈化及UPLC檢測流程

免疫磁珠高通量自動(dòng)凈化-UPLC檢測流程如圖1所示。糧食樣品經(jīng)過提取后，吸取上清液加入試劑盒稀釋孔中，隨即將試劑盒放入真菌毒素全自動(dòng)凈化儀中，啟動(dòng)凈化程序，自動(dòng)完成樣品的稀釋、毒素富集、雜質(zhì)清洗和目標(biāo)物的洗脫等流程。凈化結(jié)束后準(zhǔn)確吸取洗脫液進(jìn)行氮吹、復(fù)溶和過濾，即可上機(jī)檢測。每個(gè)樣品的磁珠使用量為1 mg，含有抗體約0.4 mg。

圖1 免疫磁珠高通量自動(dòng)凈化-UPLC檢測流程圖Fig.1 Flow chart of high-throughput automatic purification based on immunomagnetic beads coupled with UPLC

1.3.4 儀器條件

真菌毒素全自動(dòng)凈化儀凈化程序：磁珠轉(zhuǎn)移到樣品孔，混合5 min，磁吸7.5 min；磁珠轉(zhuǎn)移到清洗孔（2 個(gè)），每個(gè)清洗孔清洗1 min，磁吸1 min；磁珠轉(zhuǎn)移到洗脫孔，洗脫1 min，磁吸1 min后將磁珠轉(zhuǎn)移到磁珠回收孔，凈化結(jié)束。單個(gè)樣品中玉米赤霉烯酮的自動(dòng)凈化時(shí)間為26 min。

UPLC條件：色譜柱為BEH-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃，樣品溫度10 ℃；進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相：水-乙腈（45∶55，V/V）溶液，等度洗脫，流速0.2 mL/min。熒光檢測波長：激發(fā)波長303 nm，發(fā)射波長440 nm。

1.3.5 分析方法的驗(yàn)證

對免疫磁珠高通量自動(dòng)凈化-UPLC方法進(jìn)行加標(biāo)回收率、重復(fù)性、穩(wěn)定性、線性范圍、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）測定。LOD和LOQ采用逐級稀釋法得到，峰響應(yīng)值RSN=3時(shí)確定LOD，RSN=10時(shí)確定LOQ。對糧食陰性樣品（小麥、玉米）進(jìn)行3 個(gè)不同添加量水平（低、中、高）基質(zhì)加標(biāo)回收率的測定。基質(zhì)加標(biāo)后在室溫25 ℃放置過夜，以蒸發(fā)加入標(biāo)準(zhǔn)溶液中的有機(jī)溶劑。除基質(zhì)加標(biāo)回收率的研究，還通過檢測國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或質(zhì)控樣品評估該方法的準(zhǔn)確性和精密性。在60 μg/kg加標(biāo)量測定重復(fù)性，重復(fù)測定4 d，考察該方法的穩(wěn)定性。采用t檢驗(yàn)和Bland-Altman法對免疫磁珠和免疫親和柱凈化法之間的差異進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2016軟件計(jì)算，并使用OriginPro 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁珠與玉米赤霉烯酮反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

將免疫磁珠與玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加量60 μg/kg）反應(yīng)，分別考察不同反應(yīng)時(shí)間（2、5、8、12 min）下磁珠與玉米赤霉烯酮的結(jié)合效率（圖2）。反應(yīng)5 min后磁珠吸附玉米赤霉烯酮的回收率可達(dá)99.36%。反應(yīng)時(shí)間超過5 min后，回收率未明顯提高。因此，在免疫磁珠自動(dòng)凈化過程中，免疫磁珠與玉米赤霉烯酮反應(yīng)5 min即可達(dá)到預(yù)期效果。

圖2 免疫磁珠與玉米赤霉烯酮反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化（n=3）Fig.2 Optimization of reaction time between immunomagnetic beads and zearalenone (n = 3)

2.2 樣品提取液的優(yōu)化

在全麥粉和玉米全粉陰性樣品中加入玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加量60 μg/kg），加標(biāo)回收率如圖3所示。70%甲醇-水、90%乙腈-水和70%乙腈-水3 種提取液的加標(biāo)回收率在合理范圍內(nèi)，但是70%甲醇-水對小麥和玉米基質(zhì)的提取效果相對較差。當(dāng)免疫磁珠從提取稀釋液中識別和富集玉米赤霉烯酮時(shí)，較大比例的有機(jī)試劑會對免疫磁珠上的抗體產(chǎn)生破壞作用。采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈（0%、5%、10%、15%、20%、30%）作為提取稀釋液進(jìn)行測定，將免疫磁珠與玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加量60 μg/kg）反應(yīng)測定其加標(biāo)回收率，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)提取稀釋液中乙腈體積分?jǐn)?shù)達(dá)到30%時(shí)，玉米赤霉烯酮的加標(biāo)回收率明顯下降，僅為65.1%。因此，為保證抗體不被破壞，本方法采用有機(jī)試劑相對含量較低的70%乙腈-水作為提取液。

圖3 不同提取液對糧食陰性樣品加標(biāo)回收效果的影響Fig.3 Effects of different extraction solvents on recoveries of spiked grain matrices

圖4 乙腈體積分?jǐn)?shù)對免疫磁珠回收率的影響（n=2）Fig.4 Effect of acetonitrile concentration on recoveries of zearalenone (n = 2)

2.3 免疫磁珠對不同糧食基質(zhì)凈化效果的優(yōu)化

如圖5所示，經(jīng)過免疫磁珠凈化后小麥、玉米等糧食基質(zhì)的UPLC圖均較為干凈，目標(biāo)峰附近沒有干擾物，因此本方法的雜質(zhì)凈化效果良好。

圖5 2種糧食基質(zhì)玉米赤霉烯酮免疫磁珠凈化的UPLC圖Fig.5 UPLC profiles of zearalenone purified with immunomagnetic beads from two grain matrices

2.4 分析方法的驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性范圍、LOD和LOQ

在5～500 ng/mL范圍內(nèi)制備了一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以峰面積（Y）與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=727.11X+2 151.76，R2=0.999 98，其具有良好的線性，LOD為3.5 μg/kg，LOQ為12.0 μg/kg，均低于我國谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量[5]，可滿足日常檢測要求。

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

為考察該方法的準(zhǔn)確度和精密度，對玉米全粉和全麥粉陰性樣品添加30、60、120 μg/kg的玉米赤霉烯酮進(jìn)行含量和加標(biāo)回收率測定，結(jié)果見表1。玉米和小麥進(jìn)行低、中、高3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率在99.04%～109.26%之間，變異系數(shù)不大于6.88%。選用玉米全粉、全麥粉、糙米粉、小麥粉等糧食基質(zhì)中玉米赤霉烯酮成分的國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或質(zhì)控樣品驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，檢測結(jié)果如表2所示，測定值在標(biāo)準(zhǔn)值及其擴(kuò)展不確定度范圍內(nèi)，變異系數(shù)不大于3.54%，檢測結(jié)果較理想。

表1 玉米赤霉烯酮免疫磁珠凈化的加標(biāo)回收率和變異系數(shù)（n=3）Table 1 Spiked recoveries and coefficients of variation of zearalenone with immunomagnetic bead purification (n = 3)

表2 不同糧食基質(zhì)玉米赤霉烯酮成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控樣品檢測結(jié)果（n =2）Table 2 Results of zearalenone determination in reference materials and quality control samples for different grain matrices (n = 2)

2.4.3 日間精密度考察

采用免疫磁珠自動(dòng)凈化方法檢測連續(xù)4 d的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。本凈化方法連續(xù)4 d的加標(biāo)回收率平均在101.63%～103.01%之間，日間精密度在4.88%～5.72%之間，重復(fù)性良好。

表3 本方法日間精密度Table 3 Intraday precision of the method%

2.4.4 免疫親和柱凈化法（國標(biāo)法）和免疫磁珠自動(dòng)凈化法的評測

本實(shí)驗(yàn)分別采用免疫親和柱凈化法（國標(biāo)法）和全自動(dòng)凈化儀-免疫磁珠凈化試劑盒對采集于全國不同地區(qū)新收獲的小麥、玉米、糙米共22 個(gè)陽性樣品進(jìn)行測定。采用配對t檢驗(yàn)，評價(jià)2 種凈化方法測定結(jié)果的一致性。如表4所示，通過t檢驗(yàn)可知，td值（1.46）小于理論t0.05(21)值（2.08），P＞0.05，2 種凈化方法的測定結(jié)果無顯著差異。

表4 免疫親和柱和免疫磁珠凈化測定結(jié)果（n=2）Table 4 Results of zearalenone determination in freshly harvested wheat, corn and brown rice samples by purification using immunoaffinitycolumn and immunomagnetic beads (n = 2)

采用Bland-Altman法對2 種凈化方法之間的差異進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示，免疫磁珠凈化方法與免疫親和柱法效果一致[27-29]。有4.5%（1/22）的點(diǎn)在95%一致性界限之外。在一致性界限范圍以內(nèi)，免疫親和柱凈化法和免疫磁珠凈化法的測定值相比，差值的絕對值最大為17.5 μg/kg，差值平均值為-1.8 μg/kg。這2 種凈化方法的差異在可接受范圍內(nèi)，因此可以認(rèn)為這2 種方法的凈化效果具有較好的一致性，在凈化和富集糧食中玉米赤霉烯酮時(shí)，可以互相代替使用。另外，使用免疫磁珠凈化糧食中玉米赤霉烯酮的成本更低，每個(gè)樣品檢測成本約是免疫親和柱法的二分之一。

圖6 2種凈化方法Bland-Altman差值法分析圖Fig.6 Bland-Altman plot showing good agreement between two purification methods

3 結(jié) 論

本研究建立了糧食中玉米赤霉烯酮免疫磁珠高通量自動(dòng)凈化-UPLC的檢測方法，并對全麥粉和玉米全粉陰性樣品添加不同量的玉米赤霉烯酮，檢測其加標(biāo)回收率，同時(shí)使用國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控樣品對本方法進(jìn)行了驗(yàn)證。相比于目前廣泛使用的免疫親和柱凈化方法，本方法具有操作簡單、自動(dòng)化、高通量和成本低等優(yōu)點(diǎn)。采用配對t檢驗(yàn)和Bland-Altman法分析，結(jié)果表明免疫磁珠凈化與免疫親和柱凈化方法效果一致。UPLC分析方法的LOD、LOQ滿足糧食中玉米赤霉烯酮日常檢測需求。

免疫磁珠凈化方法配套使用的真菌毒素全自動(dòng)凈化儀可同時(shí)凈化10～24 個(gè)樣品，平均每個(gè)樣品的凈化時(shí)間約為2～3 min，可有效減少對操作人員的操作要求，實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化提取糧食中玉米赤霉烯酮；UPLC分析方法的準(zhǔn)確度和精密度較高，為高效檢測糧食中玉米赤霉烯酮提供參考。